基因工程双特异抗体研究进展

双特异抗体特别是双特异性单链抗体、亮氨酸接链双特异性抗体、双特异性单链抗体毒素等是近几年来发展起来的很有前途的监床诊疗生物制剂 ,本文对其基因构建、边接肽设计、表达产物及活性等方面的新进展作了重点论述。

双特异性抗体药物应用进展

基因工程的飞速发展推动了新型双功能抗体药物的成功研制。目前双功能抗体药物主要应用于肿瘤的免疫治疗、自身免疫疾病和感染类疾病的治疗,在组织再生和临床诊断领域也有应用。就双特异性抗体的发展史进行了简要回顾,对其在免疫治疗、组织再生和临床诊断等领域中的应用进展进行了综述,并展望了未来的发展方向,以期为新型双特异性抗体药物的研制提供参考。

双特异性抗体对LAK细胞增殖和细胞毒作用影响的体外研究

LAK细胞过继免疫治疗恶性肿瘤具有一定的疗效，南于不能特异性识别和攻击靶细胞影响了LAK细胞的治疗效果进一步提高。双特异抗体能同时识别效应细胞和靶细胞，使其特异地结合，选择性地将靶细胞杀死，本研究应用化学偶联剂SPDP将鼠源抗CD3与抗HBs连接得到化学嵌合双特异性抗体，

抗HBsAg和抗RBC双特异minibody载体的构建及表达

目的 :用抗HBsAg和抗RBC单链抗体构建双特异minibody抗体模型。方法 :将人IgG1CH3 经点突变方式 ,在CH3界面由大分子氨基酸代替小分子氨基酸形成“knob”(T36 6W) (杵状结构 ) ,另一个CH3 分子由 3个小分子氨基酸代替 3个大分子氨基酸形成“hole”(T36 6S :L36 8A :Y40 7V) (臼状结构 ) ,并在此基础上在适当位置引入半胱氨酸残基形成二硫键 (S35 4C :T36 6W /Y34 9C :T36 6S :L36 8A :Y40 7V)。然后将“knob”和“hole”分别接连于抗HBsAg和抗RBC单链抗体基因 3’端 ,并将两基因组装于同一表达载体中 ,在大肠杆菌中分泌表达。结果 :依CH3 界面不同共构建 3种不同的表达载体 ,分别带有①野生型CH3 ,②杵臼结构 (T36 6W/T36 6S :L36 8A :Y40 7V)突变型CH3 ,③杵臼结构加二硫键 (S35 4C :T36 6W/Y34 9C :T36 6S :L36 8A :Y40 7V)突变型CH3 。大肠杆菌分泌表达后 ,ELISA法检测抗HBsAg和抗RBC活性 ,3种表达上清均有相同的抗HBsAg和抗RBC活性 ;两种带有突变型CH3 的minibody用血球凝集法可检测到抗HBsAg和抗RBC双特异活性。结论 :CH3 界面经适当改造可促进异源二聚体形成 ,并在大肠杆菌获得功能性表达 ,得到双特异minibody。

用双特异探针技术定性定量分析微型原甲藻

针对微型原甲藻核糖体大亚基和小亚基RNA分别设计了大亚基探针(LSU probe)和小亚基探针(SSU probe),发展了对微型原甲藻进行定性和定量分析的双特异探针技术.分析数据表明针对微型原甲藻核糖体大亚基RNA的LSU probe能够特异地将微型原甲藻和其他7种微藻分开,而且检测信号的强弱在一定的范围内与细胞数呈线性关系;由于针对微型原甲藻核糖体小亚基的SSU probe探针由于与具齿原甲藻存在核酸序列一致性,该探针与具齿原甲藻有严重的交叉反应,但未发现与海洋原甲藻和其他藻的交叉反应.另外,研究还优化了破碎微型原甲藻细胞所需的超声时间以及获得探针的特异性所需的S1酶反应温度.本研究为实现对微型原甲藻海水样品的快速准确监测奠定了基础.

scBsAb1/17双特异性抗体对小鼠类风湿性关节炎模型的治疗效果

目的比较不同剂量scBsAb1/17对Ⅱ型胶原(CII)诱导类风湿性关节炎(CIA)模型小鼠的治疗效果,及scBsAb1/17双特异性抗体与单价抗体(anti-IL-1βscFv和anti-IL-17scFv)在CIA模型小鼠中的治疗效果。方法利用CII建立小鼠类风湿性关节炎模型,小鼠成模后开始治疗,每2 d给药1次,治疗29 d。治疗结束后对小鼠关节炎指数进行临床评分,检测各组小鼠血清中CII抗体、CII特异性刺激的脾细胞增殖指数和脾脏中IL-2、IL-1β、IFN-γ、IL-6和TNF-α等细胞因子的表达水平。结果与CIA模型对照组相比,所有治疗组都能明显减轻CIA小鼠的临床症状,并明显降低血清中CII抗体水平、脾细胞增殖指数及脾脏中TNF-α、IL-6、IL-2、IL-1β和IFN-γ的表达量。相同剂量下scBsAb1/17治疗组的脾细胞增殖指数明显低于anti-IL-1βscFv治疗组(P<0.05);并且scBsAb1/17治疗组小鼠脾脏中IL-6、IL-2、IL-1β和IFN-γ的表达量明显低于anti-IL-1βscFv和anti-IL-17AscFv单独治疗组(P<0.01或P<0.05)。结论 scBsAb1/17及单价抗体对CIA模型小鼠都有治疗效果;不同剂量scBsAb1/17对CIA模型鼠的治疗效果呈剂量依赖性;相同剂量条件下,scBsAb1/17的治疗效果要优于单价抗体。

运用双特异分子探针技术对胶州湾三种硅藻的检测

利用本实验室首创的双特异分子探针技术对胶州湾常见的3种硅藻-旋链角毛藻(Chaeto-ceros curvisetus Cleve)、尖刺拟菱形藻(Pseudo-nitzschia pungens(Grunowex Cleve)Halse)和中肋骨条藻(Skeletonema costatum(Greville)Cleve)进行定性与定量分析。结果表明,无论是对实验室样品还是自然样品进行检测,本技术均有较好的适用性,对3种目标藻的最低检测细胞数分别为4.2×104、9.4×103和6.0×104个细胞。统计分析表明,双特异分子探针技术对3种目标藻的分析结果与经典的显微镜镜检结果没有显著性差异。本技术利用了多孔酶标板进行检测,整个实验过程约7h,可在较短时间内分析大量样品中的多种微藻,为同时监测多种赤潮藻开辟了一条新途径。

双特异抗体增效内皮祖细胞移植促进心肌血管新生

目的探讨在双特异抗体(BiAb)的辅助下,内皮祖细胞(EPCs)移植可否更好的定向归巢大鼠缺血心肌促进血管新生。方法体外分离培养鉴定SD大鼠骨髓源性内皮祖细胞;开胸结扎SD大鼠冠状动脉左前降支制备心肌梗死模型;以anti-CD34(能识别内皮祖细胞)和抗肌凝蛋白轻链抗体(AMLCA)(能特异性结合缺血心肌)2种抗体,化学交联法制备BiAb(CD34×AMLCA)。将此BiAb与EPCs经尾静脉输入心肌梗死大鼠(EPCs+BiAb组),另设单纯EPCs移植组、单纯BiAb组、对照组。细胞移植35 d后M型超声心动图检测大鼠左室收缩功能,免疫组织化学法行5-Brdu及VIII因子检测,实时荧光定量PCR及Western blot检测大鼠心肌VEGF mRNA与蛋白表达。结果与其余组相比,EPCs+BiAb组射血分数及短轴缩短率增加,心梗区周围5-BrdU阳性细胞数及微血管密度增加,心肌VEGF mRNA与蛋白表达增加(P<0.05)。结论 CD34×AMLCA双特异抗体可增效大鼠骨髓源性内皮祖细胞定向归巢到大鼠缺血心肌,改善心功能,更好的促进血管新生。

抗人卵巢癌COC183B2/抗CD3单链双特异抗体的构建和表达

目的 :构建和表达一种可与卵巢癌细胞和淋巴细胞结合的双特异抗体。方法 :利用PCR分别扩增抗人CD3单链抗体 (singlechainvariablefragment,ScFv)重链可变区 (variableregionoftheheavychain ,VH)和轻链可变区 (variableregionofthelightchain ,VL) ,重组抗人CD3ScFv ,经测序后将其克隆入有链间连接肽基因序列的载体pALM中 ,再将抗人卵巢癌COC183B2ScFv克隆至紧邻链间连接肽前形成COC183B2 /抗CD3单链双特异抗体(single-chainbispecificantibody ,scBsAb)的重组。最后将COC183B2 /抗CD3scBsAb克隆入表达载体 pTMFC中进行表达 ,同时分别表达抗人卵巢癌单抗COC183B2和抗人CD3单抗的ScFv作为对照组。用ELISA、流式细胞学方法和玫瑰花环实验对scBsAb进行免疫学活性测定。结果 :成功构建抗人卵巢癌COC183B2 /抗CD3scBsAb ;其表达的蛋白链相对分子质量约 6 0 ;ELISA结果显示scBsAb可与抗原OC183B2结合 ,流式细胞学结果显示scBsAb可与抗原CD3结合 ,花环实验显示scBsAb在体外可引导效应细胞聚集在靶细胞周围。结论 :构建和表达抗人卵巢癌COC183B2 /抗CD3scBsAb成功 ,且具有与抗原OC183B2。

CDC25双特异磷酸酯酶及Smad3在食管鳞状细胞癌的表达及其意义

目的:探讨CDC25双特异磷酸酯酶(CDC25A,CDC25B)及Smad3在食管鳞状细胞癌的表达及其与食管癌临床病理特征之间的关系。方法:采用免疫组织化学方法(SP法)检测52例食管鳞状细胞癌手术切除的癌组织及癌旁组织(24例正常食管黏膜上皮,25例非典型增生组织)中CDC25A和CDC25B蛋白表达;采用流式细胞术(FCM)对上述标本中CDC25A、CDC25B和Smad3蛋白进行定量检测。采用SPSS 11.5软件进行统计分析。结果:CDC25A和CDC25B在癌组织中的阳性表达率均高于不典型增生组织和正常黏膜(P<0.01),非典型增生组织与手术切缘正常组织之间差异无显著性(P均>0.05)。在癌组织中,中、低分化、侵袭至纤维膜组CDC25A、CDC25B蛋白的表达明显高于高分化、未侵袭至纤维膜组(P<0.01),淋巴结转移组CDC25A蛋白的表达显著高于无淋巴结转移组(P<0.01),CDC25B蛋白表达与淋巴结转移无关(P>0.05)。癌组织中Smad3蛋白阳性表达率明显低于非典型增生组织和正常组织(P均<0.01),非典型增生组织与正常组织之间差异无显著性(P均>0.05)。Smad3蛋白与CDC25A蛋白的表达呈负相关(r=-0.482,P=0.007)。结论:CDC25A的异常表达可能参与了食管鳞状细胞癌的发生、发展及转移,其有望成为评价食管癌恶性程度和预后的指标,Smad3蛋白的下调可能与食管癌中CDC25A蛋白含量升高有关。而CDC25B可能只是在癌变早期发挥作用。

双特异抗体导向骨髓中活化T细胞清除骨髓中肿瘤细胞

先用抗CD3单抗和IL-2激活肺癌患者骨髓中的T淋巴细胞,然后按不同比例将人肺癌细胞株PC84045细胞掺入到骨髓细胞中,再加入能同时识别CD3抗原和人肺癌细胞表面抗原的双特异抗体CD3-ALTO4,在IL-2和IL-3存在下共同培养3d后测试.在T细胞与PC84045癌细胞之比为8:1时,对PC84045肺癌细胞净化效率为4Logs,16;1时为5Logs,并在NC裸鼠体内证实清除效果是确切的.净化后的骨髓CFU-GM、BFU-E收获率均>85%(P>0.05;P>0.05);而且净化后的骨髓中的T细胞仍保持着对PC84045肺癌细胞很强的杀伤能力(P<0.01).双特异抗体CD3-ALTO4能有效地导向骨髓中活化T细胞清除污染的肿瘤细胞,造血干细胞无明显损伤.本文方法处理的骨髓细胞还保持着高度特异的细胞毒活性,移植这样的骨髓细胞将会在体内进一步清除化疗残存的肿瘤细胞,加速移植后免疫功能再建,降低复发.

抗尿激酶及人纤维蛋白双特异单克隆抗体体内导向溶栓作用的实验研究

用杂交杂交瘤技术制备抗尿激酶及人纤维蛋白双特异单克隆抗体—10H8;建立了稳定的家兔颈静脉溶栓模型;研究了10H8体内导向溶栓特征。研究结果显示,与单独尿激酶比较导向溶栓药(尿激酶/10H8)的体内溶栓效能及溶栓特异性均有显著提高。导向溶栓药的出现为实现临床溶栓的高效特异化带来希望。

微环DNA表达抗EpCAM/抗CD3双特异BiTE分子的抗卵巢癌细胞体外实验研究

目的探讨抗EpCAM/抗CD3 BsAb分子蛋白对体外卵巢癌细胞生长的抑制效果。方法采用非病毒载体微环DNA表达抗EpCAM/抗CD3 BsAb分子蛋白。观察不同浓度(1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8μg/mL)抗EpCAM/抗CD3 BsAb分子蛋白加至卵巢癌细胞及T细胞中,经6 h和12 h培育后,利用倒置荧光显微镜观察活细胞与死亡细胞数量及形态变化。结果倒置显微镜下可见加抗体后卵巢癌细胞与T细胞明显聚集成块,周围见大量死亡细胞。相同时间下,随着浓度的增加,T细胞介导的卵巢癌肿瘤细胞的杀伤效果并不会一直增强。当浓度达到1×10^-4μg/mL时,培育6 h和12 h时的杀伤均达到最大,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论新型的微环DNA表达系统所表达的抗EpCAM/抗CD3 BsAb对体外卵巢癌细胞生长具有抑制作用,未来可作为一种有效的抗卵巢癌肿瘤的靶向治疗药物。

尿激酶-抗尿激酶抗纤维蛋白双特异单克隆抗体复合物在小鼠体内的药物动力学

目的 :研究尿激酶 -抗尿激酶抗纤维蛋白双特异单克隆抗体复合物 (U K- BI9E1 1 )在小鼠体内的药物动力学特征。方法 :小鼠 iv U K- BI9E1 1 后 ,用平板法测定不同时间小鼠血清中尿激酶的活性 ,并计算其药物动力学参数。结果 :本方法重现性好 ,灵敏度高 ;UK- BI9E1 1 在血中的经时变化过程符合二室模型。与注射尿激酶所得的药物动力学参数相比 ,注射 UK- BI9E1 1后的 T1 /2α、T1 /2β均延长。结论 :BI9E1 1 与 UK形成复合物后 ,可延长尿激酶在血中的 T1 /2α、T1

双特异抗体介导活化T细胞杀灭耐药肿瘤细胞

原发性和继发性的肿瘤细胞对化疗药物的抵抗是肿瘤化学治疗失败的主要因素，目前已用离子通道阻断剂试图逆转肿瘤细胞由耐药变为敏感，但临床应用产生的效果甚微，因此需要另辟蹊径。本文报告双特异性抗体能够介导T细胞杀灭耐药的肿瘤细胞。

双特异抗体在体内模拟特异性B细胞递呈抗原

在体外实验的基础上，我们将既具有抗Ｂ细胞Ｓｍｌｇ又具有抗破伤风类毒素（ＴＴ）的双特异抗体注入小鼠体内，与非特异Ｂ细胞结合后，成为模拟的ＴＴ特异性Ｂ细胞，以用于进一步探讨Ｂ细胞在体内的抗原递呈能力。通过比较具备与不具备模拟特异Ｂ细胞两类小鼠对ＴＴ免疫应答的强度，说明模拟的特异Ｂ细胞在体内能有效地摄取、处理和递呈相应抗原。证实特异性Ｂ细胞在免疫应答启动阶段起着重要的传递抗原信息作用。

鼻咽癌双特异性抗独特型抗体体外抗肿瘤免疫机制初探(英文)

目的:比较鼻咽癌双价双特异性抗独特型抗体G22-I50与单价的抗独特型抗体G22,I50在体外抗肿瘤免疫情况,并对其可能的机制作初步探讨。方法:诱导表达G22-I50,G22,I50 3种蛋白并用Western印迹及ELISA方法进行活性鉴定。常规分离人外周血单个核细胞(PBMC),分别用G22-I50,G22,I50抗独特型抗体刺激并培养,采用MTT法、LDH释放法分别观察淋巴细胞增殖情况和细胞毒作用,ELISA法测定各抗独特型抗体刺激后培养上清液中IFN-γ,IL-2,IL-4的水平,流式细胞术检测刺激后淋巴细胞表型的改变。结果:Western印迹分析表明表达的G22-I50,G22,I50蛋白均可与FC2(Ab1)特异性地结合;直接ELISA结果表明复性后的蛋白已恢复活性,可用于体外实验研究。与G22、I50组相比,G22-I50刺激后的PBMC增殖明显,且对鼻咽癌细胞HNE2有特异的杀伤作用。G22-I50刺激后的PBMC培养上清液中IFN-γ,IL-2水平均比G22,I50组有所增加,而对IL-4水平没有明显影响。流式细胞术显示刺激后的PBMC中CD4+,CD8+T细胞比例增加,CD4+/CD8+比率增加,而CD4+CD25+T细胞的比例有所减少,其中以G22-I50组最为明显。结论:G22-I50具有更强的免疫原性并能增强PBMC的特异性杀瘤作用,其机制可能与促进PBMC的增殖,诱导具有抗肿瘤作用的Th1细胞因子的分泌并活化CD8+T细胞,抑制CD4+CD25+T细胞的表达有关。

应用双特异分子探针技术定性定量检测圆海链藻(Thalassiosira rotula)

设计了一套圆海链藻(Thalassiosira rotula)特异性探针,运用双特异分子探针技术,对圆海链藻(Thalassiosira rotula)进行了定性定量检测。结果表明,本实验中设计的一套探针与其它十几种藻无交叉反应,具有种特异性;细胞裂解液直接杂交检测优于提纯RNA样品检测;对自然样品做了初步检测,发现天然海水中的其它浮游生物对该检测方法影响很小。

抗纤维蛋白和抗尿激酶双特异单克隆抗体的研制

利用分泌抗纤维蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经在８－氨鸟杂嘌呤内诱导突变，使其成为对ＨＡＴ敏感细胞株．以此突变株与用尿激酶免疫小鼠的脾细胞融合，经筛选获得一株分泌双特异单克隆抗体的杂交瘤细胞９Ｅｌｌ，在体外有明显的溶栓效果。经二年来检测证明，该细胞株是稳定的。

抗辣根过氧化物酶和猪囊尾蚴的双特异单克隆抗体研制

双特异单克隆抗体是采用杂交瘤技术、化学偶联、基因工程方法制备的能够识别两种抗原的抗体或抗体复合物。近年来双特异单克隆抗体在免疫学及免疫检测、生物学等其它领域有着广泛的应用前景。