双特异性磷酸酶-1对小胶质细胞极化及颞叶癫痫发作的影响

目的探讨双特异性磷酸酶-1(DUSP1)对小胶质细胞极化及颞叶癫痫(EP)发作的影响。方法采用慢病毒转染技术构建DUSP1正常表达组(DUSP1^(normal)组)、DUSP1高表达组(DUSP1^(over)组)、DUSP1低表达组(DUSP1^(low)组)小鼠,每组12只,将这些小鼠又分为DUSP1^(normal)+对照(Con)组、DUSP1^(normal)+EP组、DUSP1^(over)+Con组、DUSP1^(over)+EP组、DUSP1^(low)+Con组和DUSP1^(low)+EP组,每组6只。取DUSP1^(normal)+EP组、DUSP1^(over)+EP组及DUSP1^(low)+EP组小鼠分别腹腔注射氯化锂溶液(125 mg/kg)、硫酸阿托品溶液(1 mg/mL)及盐酸匹罗卡品溶液(50 mg/kg),构建颞叶EP模型。评估EP小鼠注射后2 h内EP发作等级,记录达到Ⅳ级的时间为潜伏期。将EP小鼠处死,取完整脑组织用于免疫荧光检测,取颞叶组织用于炎症细胞因子、DUSP1及小胶质细胞调控蛋白检测。结果与DUSP1^(normal)组比较,DUSP1^(over)组DUSP1/β-actin及DUSP1 mRNA表达水平均升高,DUSP1^(low)组DUSP1/β-actin及DUSP1 mRNA表达水平均降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与DUSP1^(normal)+EP组比较,DUSP1^(over)+EP组小鼠EP发作达Ⅳ级潜伏期明显延长,DUSP1^(low)+EP组小鼠EP发作达Ⅳ级潜伏期明显缩短,差异均有统计学意义(P<0.05)。与DUSP1^(normal)+Con组比较,DUSP1^(normal)+EP组小鼠颞叶组织中M1型小胶质细胞极化标志物CD16、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA水平均升高,炎症细胞因子TNF-α、IL-6水平均升高,IL-10水平降低,DUSP1诱导小胶质细胞极化相关蛋白p-胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2、p-c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p-p38蛋白表达水平均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与DUSP1^(normal)+EP组比较,DUSP1^(over)+EP组小鼠颞叶组织中M1型小胶质细胞极化标志物CD16、TNF-α、IL-1β和iNOS mRNA水平均降低,M2型小胶质细胞极化标志物CD206、转化生长因子-β、精氨酸酶1与几丁质酶样蛋白mRNA水平均升高,炎症细胞因子TNF-α、IL-6水平均降低,IL-10水平升高,DUSP1诱导小胶质细胞极化相关蛋白p-ERK1/2、p-JNK和p-p38蛋白表达水平均降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与DUSP1^(normal)+EP组比较,DUSP1^(low)+EP组小鼠颞叶组织中M1型小胶质细胞极化标志物TNF-α和iNOS mRNA水平均升高,炎症细胞因子TNF-α、IL-6水平均升高,IL-10水平降低,DUSP1诱导小胶质细胞极化相关蛋白p-ERK1/2、p-JNK和p-p38蛋白表达水平均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论氯化锂溶液-盐酸匹罗卡品溶液点燃EP小鼠颞叶组织中DUSP1蛋白表达水平降低,高表达DUSP1基因能够延长小鼠EP发作的潜伏期,其机制可能涉及抑制p-ERK1/2、p-JNK和p-p38蛋白表达来调节小胶质细胞向M2型极化。

敲低双特异性磷酸酶5(DUSP5)通过阻断NF-κB信号抑制卡介苗诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞炎性反应

目的探讨双特异性磷酸酶5(DUSP5)对卡介苗(BCG)介导的小鼠RAW264.7巨噬细胞炎性反应的调控作用。方法Western blot法检测BCG感染RAW264.7巨噬细胞0.5、1、2、4、6、8、12、24 h,DUSP5表达变化;采用小干扰RNA(siRNA)技术下调RAW264.7巨噬细胞DUSP5水平,并设置siRNA阴性对照(si-NC)组、DUSP5敲低(si-DUSP5)组、si-NC联合BCG感染组、si-DUSP5联合BCG感染组。实时定量PCR检测细胞白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-10的mRNA表达,ELISA检测细胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10含量;Western blot法检测细胞核因子κB(NF-κB)与磷酸化的NF-κB(p-NF-κB)表达变化。结果BCG感染上调RAW264.7巨噬细胞核DUSP5蛋白表达,并在BCG刺激4 h后,DUSP5表达量达到高峰;与si-NC联合BCG感染组相比,敲低DUSP5抑制细胞促炎因子IL-1β、IL-6与TNF-α表达与分泌,而抑炎因子IL-10表达不受DUSP5的影响;且敲低DUSP5抑制细胞NF-κB磷酸化。结论敲低DUSP5通过阻断NF-κB信号抑制BCG介导的巨噬细胞炎性反应。

血清双特异性磷酸酶1水平变化在儿童支气管哮喘中的临床意义

本研究旨在探讨血清DUSP1水平变化在哮喘患儿中的表达及其与哮喘发作风险、严重程度和炎症细胞因子的关系。方法:选取2020年1月至2021年2月在青岛大学附属医院儿童呼吸科就诊的哮喘急性发作期儿童52例、哮喘慢性持续期50例和健康儿童50例进行研究。在青岛大学附属医院检验科,采用酶联免疫吸附法检测血清DUSP1、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-17水平。结果:① 血清DUSP1水平在健康儿童中最高,在哮喘慢性持续期儿童中次之,在哮喘急性发作期儿童中最低(P 0.05)。④ 哮喘慢性持续期儿童血清DUSP1水平与血清TNF-α、IL-1β水平呈负相关(P 0.05)。在健康儿童中,血清DUSP1水平与炎症因子无相关性(P > 0.05)。结论:血清DUSP1水平变化可能作为预测哮喘儿童的急性发作的生物学标志物,与哮喘患儿急性发作期、慢性持续期的炎症细胞因子密切相关。

过表达双特异性蛋白磷酸酶1通过调节自噬作用减轻阿霉素诱导的心肌细胞凋亡和心肌纤维化

目的探讨过表达双特异性蛋白磷酸酶1(dual-specificity protein phosphatase 1,DUSP1)对阿霉素(adriamycin,ADR)诱导的心肌细胞凋亡和心肌纤维化的影响及作用机制。方法将SD大鼠随机分为对照组、ADR组、ADR+Ad-DUSP1组、ADR+Ad-NC组,每组10只。采用超声心动图检测大鼠心功能参数左心室舒张末内径值(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)、左心室收缩末内径值(left ventricular end systolic diameter,LVESD)、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左心室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)。实时定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法检测大鼠心肌组织中DUSP1 mRNA表达,苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色、TUNEL染色及Masson染色分别检测大鼠心肌组织病理形态学变化、心肌细胞凋亡和心肌纤维化,Western blot法检测大鼠心肌组织相关蛋白表达。结果对照组、ADR组、ADR+Ad-DUSP1组和ADR+Ad-NC组大鼠心肌组织中DUSP1 mRNA表达水平分别为1.00±0.10、0.23±0.02、0.22±0.02、0.76±0.08。与对照组比较,ADR组大鼠心肌组织中DUSP1 mRNA表达水平显著降低;心功能指标LVEDD、LVESD显著升高,LVEF和LVFS显著降低;心肌组织可见明显病理损伤,心肌细胞凋亡率和胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF)显著升高;心肌组织中B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白表达量显著降低,B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(B-cell-lymphoma-2 related protein,Bax)、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved caspase-3)、Ⅰ型胶原蛋白(typeⅠcollagen,COL-Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(typeⅢcollagen,COL-Ⅲ)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)、转化生长因子-β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)蛋白表达量显著升高;心肌组织中微管相关蛋白轻链3(microtubule associated protein light chain 3,LC3)、Beclin-1蛋白表达量显著升高、P62蛋白表达量显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与ADR组比较,ADR+Ad-DUSP1组大鼠心肌组织中DUSP1 mRNA表达水平显著升高,心功能指标LVEDD、LVESD显著降低,LVEF、LVFS显著升高;心肌组织病理形态明显改善,心肌细胞凋亡率和CVF显著降低;心肌组织中Bcl-2蛋白表达量显著升高,Bax、cleaved caspase-3、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、MMP-2、TGF-β1白表达量显著降低;心肌组织中LC3、Beclin-1蛋白表达量显著降低,P62蛋白表达量显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论过表达DUSP1可能通过抑制自噬作用减轻ADR诱导的大鼠心肌细胞凋亡和心肌纤维化。

双特异性磷酸酶1在涎腺腺样囊性癌组织中的表达及意义

目的探讨双特异性磷酸酶1(DUSP1)在涎腺腺样囊性癌(SACC)组织中的表达及其意义。方法采用免疫组化、qRT-PCR和Western blot检测48例SACC患者的癌组织和20例癌旁正常组织中DUSP1的蛋白和基因表达水平,并收集相关临床资料,分析DUSP1蛋白表达与SACC患者临床病理特征间的关系。结果 48例SACC患者标本中18例(37.5%)DUSP1阳性表达,30例(62.5%)阴性表达。qRT-PCR结果显示,SACC癌组织中DUSP1的基因表达阳性率显著低于癌旁正常组织(P<0.05),Western blot结果与其一致。不同T分期、淋巴结转移、神经侵犯、局部侵犯的患者间比较,DUSP1蛋白表达阳性率均有统计学差异(均P<0.05),而不同性别、年龄、肿瘤部位、组织学类型、远处转移的患者间比较,DUSP1蛋白表达阳性率均无统计学差异(均P>0.05)。结论DUSP1在SACC中表达下降,与T分期、淋巴结转移、神经侵犯、局部侵犯有关,有望成为SACC预后的潜在标志物之一。

双特异性磷酸酶-1过表达对肾癌细胞株A498增殖和侵袭的影响

目的构建携带人双特异性磷酸酶-1(dual specificity phosphatase-1,DUSP-1)基因的过表达慢病毒载体并包装病毒,感染人肾癌细胞株A498后观察DUSP-1的过表达对肾癌细胞株A498增殖和侵袭能力的影响。方法从p CMV6-XL5-DUSP-1质粒上获得目的基因片段,采用DNA重组技术将DUSP-1基因插入到慢病毒表达载体质粒Plv-EGFP(2A)Puro中,获得重组plv-EGFP(2A)Puro-DUSP-1载体。重组慢病毒表达质粒及辅助包装质粒p H1、p H2共转染293T细胞进行慢病毒包装,收集病毒上清并感染肾癌细胞株A498,利用Western blot检测细胞DUSP-1蛋白的表达情况。用MTS法检测细胞增殖能力的变化,Transwell法检测细胞侵袭能力的变化。结果成功构建携带DUSP-1过表达载体。包装病毒后成功感染A498细胞株,DUSP-1蛋白表达较对照A498细胞株显著上调。重组质粒组细胞在490 nm吸光值明显上升(P<0.05);细胞侵袭试验中,重组质粒组的穿膜细胞数明显高于空载体组(P<0.05)。结论成功构建了人DUSP-1基因的重组慢病毒表达载体p LV-EGFP(2A)Puro-DUSP-1,进行病毒包装后成功培养稳定高表达DUSP-1基因的肾癌细胞株;DUSP-1基因的过表达具有促进肾癌细胞株A498增殖和侵袭的作用。

血清DUSP1表达对急性肺血栓栓塞患者的预后价值研究

目的 探究血清双特异性磷酸酶1(DUSP1)表达水平对急性肺血栓栓塞(APTE)患者的预后价值。方法 选取该院2020年3月至2022年7月收治的112例APTE患者作为观察组,并选取同期在该院行体检的健康者50例作为对照组。治疗后随访6个月,根据预后状况将APTE患者分为预后良好组(90例)和预后不良组(22例)。比较入院前各组间的血清DUSP1相对表达水平及肺栓塞严重程度指数(PESI)评分;采用Spearman相关性分析血清DUSP1相对表达水平与PESI评分之间的关系;采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清DUSP1相对表达水平及PESI评分对APTE患者预后的预测价值。结果 与对照组比较,观察组血清DUSP1相对表达水平升高(P<0.05);不同危险度患者血清DUSP1相对表达水平及PESI评分比较差异有统计学意义(P<0.05),高危APTE患者血清DUSP1相对表达水平及PESI评分均高于中危患者(P<0.05),中危患者均高于低危患者(P<0.05);Spearman相关性分析显示,血清DUSP1相对表达水平与PESI评分呈正相关(r=0.561,P<0.05);ROC曲线结果显示,DUSP1、PESI评分单独预测APTE患者预后不良的曲线下面积(AUC)分别为0.789、0.867,灵敏度分别为65.8%、86.8%,特异度分别为44.2%、67.2%,二者联合预测APTE患者预后不良的AUC为0.952,其灵敏度、特异度分别为92.1%、75.6%。结论 APTE患者血清DUSP1相对表达水平升高,且随着病情的加重,血清DUSP1相对表达水平逐渐增加,DUSP1是预测APTE患者预后不良的有效指标。

双特异性磷酸酶1在乳腺癌及他莫昔芬耐药病例中的表达变化

目的初步探讨双特异性磷酸酶1(DUSP1)在乳腺癌患者以及乳腺癌他莫昔芬(TAM)耐药患者中的表达变化及其与临床预后的关系。方法使用TCGA数据库分析DUSP1在1 215名不同临床病理特点的乳腺癌患者中的分布和表达情况,使用生存分析数据库分析DUSP1表达水平与乳腺癌患者生存情况的关系;收集8例乳腺癌TAM耐药前后的配对标本进行免疫组化染色,分析DUSP1在耐药前后肿瘤标本中蛋白表达的变化情况。结果 DUSP1在乳腺癌组织中的表达水平显著低于正常乳腺组织(P<0.001),且在Luminal A亚型中的表达高于其他亚型(P<0.001);DUSP1的表达水平与乳腺癌患者的总生存(P<0.05)和无复发生存(P<0.001)呈正相关,与接受内分泌治疗的乳腺癌患者的无复发生存呈正相关(P<0.001);DUSP1在8例TAM耐药患者的配对标本中表达变化未见统计学差异(P>0.05)。结论在接受内分泌治疗的患者中DUSP1高表达的患者有更好的无复发生存,但是在8例配对标本的检测中未发现DUSP1的表达差异有统计学意义。提示DUSP1与TAM耐药之间关系的探索有待更大样本的临床研究和更深入的细胞和分子生物学实验。

双特异性磷酸酶1在宫颈鳞癌中的表达及作用研究

目的分析双特异性磷酸酶1(Dual specificity phosphatase 1,DUSP1)在宫颈鳞状细胞癌(简称宫颈鳞癌)中的表达水平及其作用。方法收集2017年1月-2019年5月在新疆医科大学附属肿瘤医院妇科收治的73例Ⅰ-Ⅳ期宫颈鳞癌患者的肿瘤组织、癌旁组织及其临床病理资料。采用qRT PCR方法检测肿瘤组织及其癌旁组织中DUSP1的表达水平,分析其与临床病理参数的相关性。采用过表达DUSP1的慢病毒进行转染,设为C33a实验组和SiHa实验组;用携带无义序列的慢病毒进行转染,设为C33a对照组和SiHa对照组,共4组。用CCK-8和Transwell实验分别检测细胞增殖、侵袭及迁移能力;Western blot检测C33a实验组和对照组中的MAPK信号通路相关蛋白磷酸化水平。结果宫颈鳞癌组织中DUSP1的表达水平低于癌旁组织,无淋巴结转移患者DUSP1表达水平高于有淋巴结转移患者(P<0.05)。与C33a对照组和SiHa对照组比较,C33a实验组和SiHa实验组宫颈鳞癌细胞DUSP1表达水平显著增加(P<0.01),细胞增殖(P<0.05)、迁移(P<0.01)、侵袭(P<0.01)能力降低。与C33a对照组比较,C33a实验组宫颈鳞癌细胞p-p38、p-JNK、p-ERK的蛋白磷酸化表达水平降低(P<0.05)。结论DUSP1的过表达水平与宫颈鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭能力相关,可能是潜在的抑癌基因,有望成为临床治疗宫颈鳞癌的新型靶标。

双特异性磷酸酶1通过视神经萎缩蛋白1抑制血管平滑肌细胞钙化

目的研究双特异性磷酸酶1(DUSP1)/视神经萎缩蛋白1(OPA1)信号通路对血管平滑肌细胞钙化的作用。方法采用体外血管钙化模型,β磷酸甘油和氯化钙诱导大鼠主动脉血管平滑肌细胞钙化,茜素红S染色检测细胞钙化,ELISA测定钙含量,TUNEL检测细胞凋亡,Western blot测定DUSP1、OPA1、Runt相关转录因子2(Runx-2)、骨形态发生蛋白2(BMP-2)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)蛋白表达水平。采用细胞转染的方法过表达DUSP1和敲减OPA1表达,观察细胞钙化、钙含量、细胞凋亡率和Runx-2、BMP-2、Caspase-3表达水平。结果β磷酸甘油和氯化钙诱导血管平滑肌细胞钙化模型中,DUSP1(t=11.951,P<0.001)、OPA1(t=8.487,P<0.001)蛋白表达水平均显著下降。过表达DUSP1能促进OPA1蛋白表达(t=-8.921,P<0.001),减轻血管平滑肌细胞钙化,降低细胞钙含量、细胞凋亡率以及Runx-2、BMP-2、活化的Caspase-3的表达(P均<0.001);而敲减OPA1表达能促进血管平滑肌细胞钙化,增加细胞钙含量、细胞凋亡率以及Runx-2、BMP-2、活化的Caspase-3的表达(P均<0.001)。结论DUSP1可能通过促进OPA1蛋白表达起到抑制血管平滑肌细胞钙化的作用。

结直肠癌组织中ACOX1、DUSP14蛋白表达变化及临床意义

目的探讨结直肠癌组织中酰基辅酶A氧化酶1(ACOX1)、双特异性磷酸酶14(DUSP14)蛋白表达变化及临床意义。方法选择手术治疗的98例CRC患者,术中取癌和癌旁组织(距肿瘤边缘>2 cm)。用免疫组化染色法检测组织中ACOX1、DUSP14蛋白,用Spearman秩相关分析CRC癌组织中ACOX1与DUSP14蛋白表达的相关性,以及二者表达与临床病理参数的关系;对患者进行随访,记录其生存状况,Cox回归模型分析CRC预后的影响因素。结果CRC癌组织、癌旁组织中ACOX1蛋白阳性表达率分别为24.49%(24/98)、84.69%(83/98),二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。CRC癌组织、癌旁组织中DUSP14蛋白阳性表达率分别为79.59%(78/98)、12.24%(12/98),二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。CRC癌组织中ACOX1与DUSP14蛋白表达呈负相关(rs=-0.792,P<0.05)。与TNM分期Ⅰ、Ⅱ期,高中分化及无淋巴结转移的CRC组织比较,TNM分期Ⅲ期、低分化程度及淋巴结转移的CRC组织中ACOX1蛋白阳性表达率低,DUSP14蛋白阳性表达率高(P均<0.05)。CRC患者随访期间死亡42例,3年总生存率为57.14%(56/98)。ACOX1蛋白表达阳性与阴性患者3年生存率分别为87.50%(21/24)、47.30%(35/74),二者比较差异有统计学意义(P<0.05);DUSP14蛋白表达阳性与阴性患者3年生存率分别为48.72%(38/78)、90.00%(18/20),二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。ACOX1蛋白表达阴性、DUSP14蛋白表达阳性、TNM分期Ⅲ期及淋巴结转移为CRC患者预后的危险因素(P均<0.05)。结论CRC中ACOX1低表达、DUSP14高表达,二者表达变化与肿瘤发展及预后有关。

乳腺癌组织NRIP1、DUSP14表达及其与患者预后的关系

目的探讨核受体相互作用蛋白1(NRIP1)和双特异性磷酸酶(DUSP14)在乳腺癌组织中的表达及二者与乳腺癌患者预后的关系。方法选取2015年6月至2018年1月该院收治的乳腺癌患者124例作为研究对象,并在术后进行为期60个月的随访。免疫组织化学法检测患者乳腺癌组织及其癌旁组织中NRIP1、DUSP14的表达,分析NRIP1、DUSP14表达水平与乳腺癌临床病理特征的关系,多因素Cox回归分析乳腺癌患者预后的影响因素,Kaplan-Meier生存曲线分析乳腺癌患者术后5年的生存率。结果与癌旁组织阳性表达率比较,乳腺癌组织中NRIP1阳性表达率较高,DUSP14阳性表达率较低(P<0.05);乳腺癌组织中NRIP1的表达水平与组织学分级、临床分期、淋巴结转移、雌激素受体及Ki-67有关(P<0.05),DUSP14的表达与组织学分级、临床分期、淋巴结转移及Ki-67有关(P<0.05);NRIP1阴性表达患者术后5年生存率明显高于NRIP1阳性表达患者(P<0.05),DUSP14阴性表达患者术后5年生存率明显低于DUSP14阳性表达患者(P<0.05);NRIP1、临床分期、淋巴结转移是乳腺癌患者预后不良的危险因素(P<0.05),DUSP14是患者预后的保护因素(P<0.05)。结论乳腺癌组织NRIP1高表达,DUSP14低表达,且二者与乳腺癌患者预后不良有关。

HuR蛋白118位苏氨酸对热应激状态下的双特异性磷酸酶1的转录后调控

目的探讨RNA结合蛋白HuR 118位苏氨酸对热应激状态下的双特异性磷酸酶1(DUSP1)转录后调控机制。方法构建HuR 118位苏氨酸突变体真核表达质粒,并用脂质体转染NIH 3T3细胞,Real-time PCR检测其对DUSP1 mRNA水平的影响,Western blotting检测其对DUSP1蛋白表达的效应。结果 (1)小鼠HuR不同突变体真核表达载体质粒构建成功;(2)热休克刺激后,HuRT118磷酸化明显增强;(3)过表达HuR(WT)与HuR(T118E),经过热休克刺激后,DUSP1 mRNA水平明显升高,其蛋白表达也有上调;过表达HuR(T118E)时,DUSP1的mRNA水平明显上调,而蛋白水平在热休克刺激前后均上调,其表达变化无差异而过表达HuR(T118A),热休克刺激前后DUSP1 mRNA水平及蛋白表达均下调;(4)热休克刺激下,HuR(WT)可以从细胞核内转位到细胞质并形成颗粒;当过表达HuR(T118E)时,在静息状态下,HuR(T118E)弥散分布于细胞质,热休克刺激会使其在细胞质形成明显的颗粒;而过表达HuR(T118A)时,热休克刺激并不能使其移位出核。结论 RNA结合蛋白HuR参与了DUSP1的转录后调控,可以通过其118位的苏氨酸磷酸化提高热休克刺激后的DUSP1的基因及蛋白水平。

长链非编码RNA双特异性磷酸酶5假基因1对三阴性乳腺癌细胞生物学行为的作用

目的探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)双特异性磷酸酶5假基因1(dual-specificity phosphatase 5 pseudogene 1,DUSP5P1)对三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)细胞生物学行为的作用。方法采用实时荧光定量PCR法检测TNBC细胞系MDA-MB-231、4T1、MDA-MB-468及正常人乳腺导管上皮细胞MCF-10A中lncRNA DUSP5P1的表达水平;将MDA-MB-231细胞系分为对照组、sh-vector组和sh-DUSP5P1组,分别不感染慢病毒、只感染空载质粒及感染sh-DUSP5P1-慢病毒(lentivirus,lenti)。采用MTT实验和克隆形成实验检测细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力,Western Blot实验检测上皮标志物E-cadherin和间质标志物Vimentin、Snail的表达。结果TNBC细胞系MDA-MB-231、4T1及MDA-MB-468中lncRNA DUSP5P1的表达水平均明显高于正常人乳腺导管上皮细胞系MCF-10A(F=65.10,P<0.05)。细胞培养12、24、48、72 h后,sh-DUSP5P1组吸光度值(OD 490值)明显低于对照组和sh-vector组(分别F=33.62,90.72,41.17,77.94;均P<0.05)。细胞培养7 d后,与对照组和sh-vector组比较,sh-DUSP5P1组克隆形成数明显下降(F=575.1,P<0.05)。敲减DUSP5P1后,TNBC细胞系MDA-MB-231侵袭和迁移能力明显下降(分别F=933.30,160.20;均P<0.05),上皮标志物E-cadherin明显上升(F=6.21,P<0.05),间质标志物Vimentin和Snail明显下降(分别F=100.11,227.37;均P<0.05)。结论LncRNA DUSP5P1可能通过上皮间质转化过程促进TNBC细胞侵袭和迁移。

基于靶点人源化小鼠的PD-1/CTLA-4双特异性抗体及其IgG1亚型的抗癌活性评价

目的:构建基于靶点人源化小鼠的程序性死亡受体-1(PD-1)/细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)双特异性抗体(BsAb)并对BsAb及其IgG1亚型进行抗癌活性评价和探讨其潜在的作用机制。方法:构建和扩增并纯化不同结构及抗体亚型的PD-1/CTLA-4抗体BsAb1、BsAb2和BsAb3,对纯化BsAb进行靶点亲和力检测,采用荧光素酶报告基因实验和FCM检测抗体的生物学活性。基于B-hPD-1-hPD-L1-h CTLA-4人源化小鼠的MC38-hPD-L1结肠癌细胞移植瘤模型对BsAb进行体内药效评估,并通过移植瘤组织中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)分析PD-1/CTLA-4抗体的作用机制。结果:成功制备的BsAb1、BsAb2及BsAb3对靶点PD-1和CTLA-4均有较强的特异性亲和力、对靶点通路均有不同程度的阻滞活性,均明显抑制移植瘤的生长(P<0.05或P<0.01)。IgG1亚型BsAb体内药效更优(P<0.01),TIL分析发现BsAb2-IgG1明显增加了CTL百分率(P<0.05),显著降低了肿瘤浸润Treg细胞百分率(P<0.01),使肿瘤免疫微环境更有利于杀伤肿瘤细胞;增强ADCC活性的Fc突变体亚型BsAb2-SI则不能进一步提高抗肿瘤活性。结论:具有Fc效应功能的IgG1亚型的PD-1/CTLA-4抗体体内抗癌药效更优,因其可以更好地清除TIL中的Treg细胞。

骨钙素、骨特异性碱性磷酸酶、胰岛素样生长因子1水平对胫骨骨折患者术后骨折愈合情况的预测价值分析

[目的]分析骨钙素(BGP)、骨特异性碱性磷酸酶(BAP)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)水平对胫骨骨折患者术后骨折愈合情况的预测价值。[方法]选取我院2017年10月至2018年11月期间行髓内固定术的80例胫骨骨折患者的病例资料,术后进行为期12个月的随访,依据患者术后骨折愈合情况分为非正常愈合组15例(18.75%)与正常愈合组65例(81.25%)。比较2组患者术后1周血清中BGP、BAP、IGF-1间水平的差异并绘制ROC曲线进行评估。[结果]非正常愈合组术后1周血清BGP、BAP、IGF-1水平分别为[5.10(3.86,6.23)]μg/L、[89.35(76.39,102.41)]U/L、[334.72(314.20,365.24)]ng/mL,均低于正常愈合组的[5.69(4.55,6.98)]μg/L、[112.38(97.31,127.45)]U/L、[364.17(320.66,407.68)]ng/mL(P<0.05);BGP、BAP、IGF-1以及联合预测曲线下面积(AUC)值分别为0.782、0.881、0.841、0.912,均大于参考线,差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]血清BGP、BAP、IGF-1水平对术后骨折愈合情况具有较高的预测价值,联合检测可作为早期判断术后非正常愈合的参考依据,值得临床应用。

趋化因子CXC配体13、双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1b蛋白阳性表达与宫颈癌患者相关病理学参数的关联性探究

目的:探讨趋化因子CXC配体13(CXCL13)、双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1b(Dyrk1b)蛋白阳性表达与宫颈癌患者相关病理学参数的关联性。方法:选取2018年1月—2020年3月我院宫颈癌患者63例,取其手术切除癌组织及癌旁正常宫颈组织各63份,检测并比较两种组织中CXCL13、Dyrk1b蛋白阳性表达率,同时比较不同病理学参数癌组织CXCL13、Dyrk1b蛋白阳性表达情况,分析其阳性表达与相关病理学参数关联性。结果:癌组织CXCL13蛋白阳性表达率为65.08%(41/63),Dyrk1b蛋白阳性表达率为80.95%(51/63),均高于癌旁正常宫颈组织的0.00%(0/63)、14.29%(9/63)(P<0.05);不同病灶直径、分化程度、FIGO分期、淋巴结转移、肌层浸润深度癌组织CXCL13、Dyrk1b蛋白阳性表达均有明显差异(P<0.05);经Spearman分析得知,CXCL13、Dyrk1b蛋白阳性表达与病灶直径、FIGO分期、淋巴结转移、肌层浸润深度呈正相关,与分化程度呈负相关(P<0.05)。结论:宫颈癌组织中CXCL13、Dyrk1b蛋白均呈高表达状态,且阳性表达与相关病理学参数呈明显相关性,可作为评估病情进展的生物学标志物。

全人源双特异性c-Met/PD-L1 scFv-Fc融合蛋白的优化、制备及生物学特性鉴定

目的:通过优化设计、构建c-Met/PD-L1 scFv-Fc融合蛋白,探究重轻链不同组合形式对c-Met/PD-L1 scFv-Fc融合蛋白与肿瘤抗原结合的亲和性和特异性的影响。方法:使用生物信息学分析、基因工程抗体技术设计、优化及制备重轻链不同组合的双特异性c-Met/PD-L1 scFv-Fc融合蛋白CP1、CP2、PC1、PC2;生物分子相互作用分析仪BLItz分析融合蛋白对重组c-Met蛋白和PD-L1蛋白的亲和力,ELISA法分析其抗原结合特异性。结果:成功制备双特异性c-Met/PD-L1 scFv-Fc融合蛋白,融合蛋白CP1与重组c-Met蛋白和PD-L1蛋白的亲和力和抗原结合特异性均优于CP2、PC1和PC2。结论:重轻链不同组合形式会影响c-Met/PD-L1 scFv-Fc融合蛋白与c-Met和PD-L1蛋白的亲和力和抗原结合的特异性,融合蛋白CP1的亲和力和抗原结合的特异性最高,其对应的重轻链组合形式可用于c-Met/PD-L1 CAR表达载体的构建。

血清CA125、CYFRA21-1、CEA、NSE及ALP联合检测对原发性肺癌患者骨转移的预测价值

目的探究血清糖类抗原125(CA125)、细胞角蛋白19片段抗原21-1(CYFRA21-1)、癌胚抗原(CEA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)及碱性磷酸酶(ALP)联合检测对原发性肺癌患者骨转移的预测价值。方法选取肺癌患者104例为观察组,并根据是否发生骨转移分为骨转移组(50例)和无骨转移组(54例)。同时选取100例肺部良性病变者为对照组。收集肺癌患者临床资料,检测所有受试者血清CA125、CYFRA21-1、CEA、NSE及ALP水平。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清CA125、CYFRA21-1、CEA、NSE、ALP对肺癌患者骨转移的预测价值。采用多因素Logistic回归分析肺癌患者骨转移的影响因素。结果与对照组相比,观察组血清CA125、CYFRA21-1、CEA、NSE、ALP水平显著升高(P<0.05)。骨转移组中临床分期Ⅲ~Ⅳ期患者占比、有淋巴结转移患者占比及血清CA125、CYFRA21-1、CEA、NSE、ALP水平显著高于无骨转移组(P<0.05)。血清CA125、CYFRA21-1、CEA、NSE、ALP预测肺癌患者发生骨转移的AUC分别为0.818、0.816、0.739、0.770、0.771,5种肿瘤标志物联合检测的AUC为0.955,敏感度、特异度、AUC均显著高于各肿瘤标志物单独检测(P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,CA125、CYFRA21-1、CEA、NSE、ALP是影响肺癌患者发生骨转移的危险因素(P<0.05)。结论血清CA125、CYFRA21-1、CEA、NSE、ALP联合检测对原发性肺癌患者骨转移的预测具有较高的价值,联合诊断效能更高。

抗人B7-1及B7-2双特异性抗体的构建、表达及与抗原结合的特性分析

目的:构建及表达抗人B7-1及B7-2双特异性抗体(anti-B7-1/B7-2-Bs Ab),并分析其与相应抗原结合的特性。方法:采用PCR的方法分别从重组质粒中克隆出抗人B7-1及B7-2单链抗体基因,将其克隆入p IRES2-EGFP表达载体,并用6×His为纯化的标签。用脂质体法将两个基因转染入中华仓鼠卵巢细胞(CHO),经G418加压筛选高表达株,扩大培养并收集上清纯化。分析抗体对膜型B7-1及B7-2的识别及与其相应抗原的结合能力。以天然高表达B7-1及B7-2分子的Raji细胞用丝裂霉素处理后作为APC,人PBMC为效应细胞,分析抗体通过阻断B7-CD28共刺激信号对PBMC增殖的影响。结果:获得了稳定表达抗人B7-1/B7-2-Bs Ab的CHO细胞株及相应的抗体。该抗体与B7-1及B7-2基因转染细胞株L929-B7-1及L929-B7-2的阳性结合率分别为99.5%及62.0%。Anti-B7-1/B7-2-Bs Ab对抗人B7-1及B7-2单链抗体的竞争结合率分别为0.4%及32.4%。Anti-B7-1/B7-2-Bs Ab通过阻断B7-CD28共刺激信号使PBMC的增殖效应仅为阴性对照组的59.7%。结论:成功构建了稳定分泌抗人B7-1/B7-2-Bs Ab的CHO细胞株(命名为SA-VI)。该抗体可以识别B7-1及B7-2分子并具有良好的生物学活性。