厄贝沙坦对电压依赖性的Kv1.3和Kv1.5通道电流的阻断作用

目的通过观察厄贝沙坦对电压依赖性的Kv1.3和Kv1.5的阻断作用,探讨厄贝沙坦对此类通道的阻断可能具有的临床作用。方法使用双电极电压钳技术记录表达于非洲爪蟾卵母细胞的Kv1.3和Kv1.5钾通道电流,不同浓度厄贝沙坦灌流对其电流的影响。结果①厄贝沙坦浓度依赖性的阻断Kv1.3通道,阻断的IC50是2.46μmol/L,且阻断具有电压依赖性。②厄贝沙坦浓度依赖性的阻断Kv1.5通道,阻断的IC50是0.47μmol/L,且阻断具有显著的电压依赖性。结论厄贝沙坦阻断开放状态的Kv1.3可能是其发挥免疫调节和抗动脉粥样硬化作用的机制之一;而对开放状态的Kv1.5的阻断可能是其具备减少心房颤动发生率的作用机制之一。

Zn^(2+)增强非洲爪蟾卵母细胞ATP-激活电流

目的研究Zn2+对非洲爪蟾卵母细胞ATP激活电流(IATP)的调制作用。方法用双电极电压钳技术记录不同浓度Zn2+对IATP的影响。结果Zn2+对IATP(尤其是D1部分)的影响有明显的浓度依赖性。3×10-5mol/L(30μmol/L)Zn2+可使IATP幅值增加(117.6±8.21)%,显著高于对照值(P<0.01);并使IATP量-效曲线左上移,但并不改变反应的最大幅值。结论Zn2+对ATP-激活电流调制效应可能是通过改变配体和受体的亲和力而实现的变构调制。

非洲爪蟾卵母细胞内源性及外源性ATP和GABA受体介导的膜反应比较

目的 :对非洲爪蟾卵母细胞表达的ATP和GABA激活电流进行比较。方法 :包括mRNA和cDNA的提取、卵母细胞的微量注射及双电极电压钳技术。结果 :①在表达P2X2 或P2X4 的卵母细胞上 ,外加ATP可分别诱导一被Zn2 + 增强的内向电流。②在表达鸡脑mRNA的卵母细胞上 ,可记录到GABA激活电流 ,且此电流可被bicucul line(一种GABAA 受体选择拮抗剂 )所阻断。③在表达了人视网膜 ρ1亚基cRNA的卵母细胞上 ,外加GABA可引起一不被bicuculline阻断的内向电流 ,后者可被I4AA(一种GABAC 受体特异性拮抗剂 )阻断。④在具有滤泡膜的卵母细胞上可记录到 3种形式的ATP激活电流和一外向的慢的GABA激活电流。⑤在除去滤泡膜的卵母细胞上均未记录到ATP和GABA激活电流。结论 :卵母细胞上存在内源性的嘌呤受体、GABAB 和GABAC 受体 ;且此内源性受体存在于滤泡膜上 ;P2X2 、P2X4 嘌呤受体及GABAA 和GABAC 受体均可在卵母细胞上表达 。

酒精对大鼠颈上神经节P2X_4受体介导的ATP-激活电流的调制及机制

目的研究酒精对大鼠颈上神经节P2X4受体介导的ATP-激活电流（IATP）的调制及机制。方法将大鼠颈上神经节P2X4受体表达在非洲爪蟾卵母细胞中,应用双电极电压钳技术记录P2X4受体介导的IATP及酒精对IATP的影响。结果 11-500 mmol/L的酒精浓度依赖性地抑制P2X4受体介导的IATP,这种抑制效应是可逆的,当细胞外的酒精被冲洗后,IATP可恢复到对照值;260 mmol/L的酒精使P2X4受体介导的IATP量-效曲线平行右移,最大电流（Emax）不变,半数有效浓度（EC50）增大,浓度大于500 mmol/L的酒精不能使EC50继续增大;3酒精对IATP的抑制不具有电压依赖性,且不改变翻转电位;41 mmol/L的镁离子和10 mmol/L的酒精分别能抑制10μmol/L ATP诱发的电流,当两者同时加入到细胞外液（两者的终浓度不改变）时,对IATP的抑制呈现叠加效应。结论 1酒精对表达在非洲爪蟾卵母细胞上大鼠颈上神经节P2X4受体介导的IATP具有抑制效应,这种抑制效应具有浓度依赖性、可逆性和无电压依赖性,可能是酒精通过对P2X4受体的变构调节实现的;2酒精和镁离子在P2X4受体胞外环上可能具有不同的调制位点。

维生素C对非洲爪蟾卵母细胞ATP-激活电流的增强作用

目的研究维生素C对非洲爪蟾卵母细胞内源性ATP受体激活电流(IATP)的调制作用。方法采用双电极电压钳技术,记录细胞外液中加入不同浓度维生素C时,对外加ATP所引起的卵母细胞膜IATP的影响。结果 10-4～3×10-2mol/L浓度的维生素C对10-4mol/LIATP呈增强效应,其中以3×10-3mol/L维生素C对IATP(尤其是D1部分)的增幅最大,可使IATP(D1)幅值增加(72.1±6.5)%,显著高于对照值(P<0.01);并使IATP量-效曲线左上移,但并不改变反应的最大幅值。结论本实验表明维生素C对ATP-激活电流的调制作用呈明显的增强效应,这种效应可能是通过对P2X受体-通道复合体活性调节的结果。而维生素C对不同的ATP受体亚型分别产生何种影响,还有待于进一步的研究。

烟碱型乙酰胆碱受体β4亚基点突变体的构建

利用PCR介导的定点突变技术构建包含β4亚基的烟碱型乙酰胆碱受体点突变体模型,同时采用双电极电压钳技术,对激动剂ACh和拮抗剂α-CTx RegIIA对突变受体的活性进行检测。结果表明:β4亚基胞外N端序列第168位的异亮氨酸(Ile)成功突变成了丝氨酸(Ser),突变后的受体对激动剂ACh的活性降低,对拮抗剂α-CTx RegIIA的活性降低了1.4倍,半阻断剂量(IC50)为170 nmol·L^-1。

α7烟碱型乙酰胆碱受体点突变体的制备及其功能研究

目的利用氨基酸定点突变技术以大鼠野生型α7烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)为模板制备α7nAChR突变体。方法采用体外转录、定点突变、凝胶电泳、双电极电压钳等技术对α7nAChR进行点突变,在非洲爪蟾卵母细胞上表达α7nAChR及其突变体,并研究其受体活性功能。结果将α7nAChR第111位的丙氨酸突变为丝氨酸,制备了α7nAChR的点突变体,测定了突变体对激动剂乙酰胆碱(ACh)的半数效应浓度(EC_(50))为165.6μmol/L。结论该结果不仅为受体定点突变提供了1种方法,同时为药物筛选和研究α7nAChR结构与功能关系提供了模型。

Mg^(2+)抑制表达在爪蟾卵母细胞上P2X4受体介导的ATP-激活电流

本文旨在研究Mg2+对表达在非洲爪蟾卵母细胞上P2X4受体介导的ATP-激活电流(ATP-activated current,IATP)的调制及机理。大鼠P2X4受体野生型及突变体型cDNA在体外转录成cRNA,通过显微注射技术将该cRNA注入非洲爪蟾卵母细胞中进行表达。应用全细胞双电极电压钳技术研究Mg2+对IATP的影响。结果显示,细胞外液加MgCl2对IATP的影响如下:(1)Mg2+在0.5~10mmol/L范围内,浓度依赖性地抑制IATP,半效抑制浓度(IC50)为(1.24±0.07)mmol/L,冲洗10min后,IATP可恢复;(2)1mmol/L的Mg2+使IATP量-效曲线右下移,最大效应电流(Emax)降低了(42.0±2.1)%,但半数有效浓度(EC50)不变;(3)预加Mg2+80s后再加ATP,Mg2+对IATP抑制效应可达最大;(4)Mg2+对IATP的抑制不受膜电位的影响;(5)以100μmol/L ATP激活的电流为对照,将P2X4受体280位的天冬氨酸突变成不带电荷的谷氨酰胺后,相同浓度的ATP诱发的IATP幅值仅为对照值的(4.12±0.15)%;将280位的天冬氨酸突变成带负电荷的谷氨酸,IATP幅值和对照值相比没有显著性差异;(6)当P2X4受体280位的天冬氨酸缺失后,100μmol/L ATP诱发的IATP的幅值几乎为对照值的两倍,且0.5~10mmol/L的Mg2+对相应的IATP无明显影响。以上结果提示:Mg2+抑制P2X4受体介导的IATP是非竞争性的、可逆的、具有浓度依赖性、时间依赖性、无电压依赖性;Mg2+的这种抑制效应可能是通过作用于P2X4受体280位的天冬氨酸而实现的。

汞抑制P2X4受体介导的ATP-激活电流

目的研究汞对P2X4嘌呤受体介导的ATP-激活电流(ATP-activated currents,IATP)的影响及其特征。方法将编码大鼠P2X4受体的cDNA在体外转录成cRNA,通过显微注射技术将该cRNA注入非洲爪蟾卵母细胞中进行表达。应用全细胞双电极电压钳技术研究汞对P2X4受体介导的IATP的影响。结果大鼠P2X4受体能有效地表达于非洲爪蟾卵母细胞;汞对P2X4受体介导的IATP具有抑制作用;汞使ATP的量-效曲线右下移,最大效应电流比单独加入ATP时减小,汞的IC50是(8.9±5.3)μmol/L;随着汞孵育时间增加,对IATP的抑制效应也相应增加,并在5 min之后出现最大抑制效应;钳制电位为-120,-100,-60,-40,-20,20(mV)的情况下,汞对IATP的抑制作用差异无统计学意义。结论汞抑制P2X4受体介导的IATP具有可逆性、浓度依赖性和时间依赖性,无电压依赖性。

麻醉剂的相加效应是否表明其具有针对N-甲基-D-天冬氨酸受体的相同分子机制？

背景异氟烷和二氧化碳（carbondioxide，CO2）都能负性调节N-甲基-D-天冬氨酸受体活性，但经由的途径不同。异氟烷是一种竞争性NMDA受体拮抗剂，结合于甘氨酸靶点，而CO，通过细胞外酸化抑制NMDA受体通道。在大鼠体内异氟烷和CO2表现了最小肺泡有效浓度的加和，但是我们假定由于它们作用于不同靶点，体外抑制NMDA受体通道时并不能表现出加和性。方法NMDA受体由蛙卵母细胞表达，实验采用双电极电压钳技术。并分别检测在有CO2和无CO2时}f起NMDA应答的甘氨酸浓度。分别作出异氟烷、H＋、CO2和氯胺酮的浓度一应答曲线，代表对NMDA的抑制作用，并用希尔方程计算出各自的EC50.结果如果NMDA产生的通道抑制效果在统计学上差异没有超过50％，可再加入含有1／2EC如的二联药物制剂。1／2EC50二联药物制剂降低了NMDA受体通道的部分基线，结果如下（平均值±SD，n=5—6卵母细胞／次）：CO2＋H＋（51％±5％），CO2＋异氟烷（54％±5％），H＋异氟烷（51％±3％），CO2＋氯胺酮（67％±8％），H＋氯胺酮（64％±2％）。结论与我们之前的假定推断相反，CO，和异氟烷对NMDA受体的抑制作用有相加效应。可能的机制是，CO2酸化调节了NMDA受体的pH敏感环路，进而改变了GluNl亚基上甘氨酸靶点的亲和性。然而，氯胺酮既可以和CO，也可以与H＋发挥协同作用抑制NMDA受体。药物作用的不同机制带来对受体的相加或协同作用。不能武断地通过相加作用判断麻醉剂分子机制的共同性。