牛乳β-乳球蛋白变异体检测方法研究进展

β-乳球蛋白(β-LG)是牛乳中重要的天然活性营养物质,也是牛乳中主要的过敏原之一。β-乳球蛋白约为乳清蛋白总量的50%,是牛乳中主要的乳清蛋白,具有较强的热敏感性和致敏性,在优质乳品工业中起关键作用。其不仅作为牛奶热处理强度的评估指标,还作为食品中牛乳过敏原的标志蛋白,有效识别和检测牛乳β-乳球蛋白非常重要。已报道的牛乳β-乳球蛋白有13种变异体,其中A和B是牛乳β-LG的常见变异体,且含量最高。根据不同的检测原理,文章简述近年来牛乳β-乳球蛋白变异体的三大类检测方法,总结电泳法、色谱法和免疫法的原理、优缺点及部分应用实例,重点介绍液相色谱法和毛细管电泳法两种定量方法,并展望牛乳β-乳球蛋白未来的发展方向。

蛋白免疫印迹法检测胃癌组织Cyr61和HIF-1α蛋白的表达及其临床意义

目的侵袭转移是恶性肿瘤最重要的生物学行为之一,也是导致死亡率增加的主要原因,而肿瘤细胞发生转移的机制一直是研究的热点。研究旨在检测富含半胱氨酸61(Cyr61)蛋白和低氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白在胃癌组织中的表达水平,探讨两者与胃癌侵袭转移的关系。方法将标本分成3组,分别为49例胃癌组、49例配对的癌旁组(距癌2 cm)和49例配对的正常组(距癌5 cm以上),用免疫组织化学和蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测Cyr61和HIF-1α的蛋白表达水平,并分析两者与胃癌的临床病理特征的关系。结果免疫组织化学检测显示Cyr61在胃癌细胞的胞浆中表达,HIF-1α在胃癌细胞的胞浆/胞核中表达。进一步用Western blot检测结果显示,胃癌中Cyr61蛋白的表达水平(0.2767±0.02200)高于癌旁组织(0.2145±0.02209)和正常组织(0.1055±0.02082),癌旁组织高于正常组织(均P<0.01);胃癌中HIF-1α蛋白的表达水平(0.2663±0.02682)高于癌旁组织(0.2120±0.04087)和正常组织(0.1008±0.03867)(均P<0.01),癌旁组织高于正常组织(P<0.01)。Cyr61和HIF-1α蛋白表达的增强与肿瘤的分化程度、淋巴转移及TNM分期相关(均P<0.05)。SPERMAN等级相关分析证明了Cyr61蛋白和HIF-1α蛋白的表达呈明显正相关(r=0.411,P<0.05)。结论 Cyr61蛋白和HIF-1α蛋白在胃癌组织中呈高表达,可能与胃癌的侵袭转移有关。联合检测Cyr61蛋白和HIF-1α蛋白对指导胃癌临床及判断预后有重要价值。

免疫印迹法检测肝纤维化组织基质金属蛋白酶抑制因子-1表达水平

目的 观察实验性肝纤维化过程中金属蛋白酶组织抑制因子 1(TIMP 1)蛋白表达水平的动态变化。方法 建立四氯化碳中毒性大鼠肝纤维化模型 ,采用免疫印迹方法 (Westernblot法 ) ,测定肝纤维化不同阶段TIMP 1的蛋白表达水平。结果 正常大鼠肝组织可见TIMP 1的蛋白表达。在肝纤维化的发生、发展过程中 ,TIMP 1蛋白表达逐渐增强 ,到肝硬化阶段达到高峰。结论 TIMP 1可能是促进和影响肝纤维化。

免疫印迹法和对流免疫电泳法检测ENA抗体的评价和意义

目的 : 评价两种检测可提取性核抗原 (ENA)多肽抗体方法在临床诊断中的价值。方法 : 同时应用免疫印迹法 (IBT)和对流免疫电泳法 (CIE)检测 2 18例结缔组织病 (CTD)患者和 15 0例非结缔组织病对照血清ENA多肽抗体 ,比较两者的检测结果。结果 : CTD中用IBT法测得抗ENA抗体阳性 14 8例占 6 7.9% ,用CIE法阳性 133例占 6 1.0 % ,两者之间无显著性差异 (P >0 .0 5 )。IBT阳性而CIE阴性为 18例 ,IBT阴性而CIE阳性者 4例。IBT可以同时检测 7种ENA抗体 ,而CIE只能检测 4种ENA抗体 ,但由于两种方法抗原制作过程中某些技术性因素会出现假阴性和假阳性。结论 : IBT是一种敏感性和特异性高而广谱的ENA血清学诊断方法 ,但同时应用CIE法可以相互补充和验证 ,从而提高抗ENA抗体检测的阳性率。

电泳免疫印迹法检测公羊和鹿布氏杆菌

新西兰学者Kittelberyer等应用碱性磷酸酶结合的重组G蛋白和Tris缓冲液建立一种改良免疫印迹法来检测血清中绵羊布氏杆菌抗体。试验所检测的样本为绵羊布氏杆菌阴性的绵羊血清106份,从精液中检出绵羊布氏杆菌的公山羊血清69份,感染公山羊群的血清110份。

应用双向电泳、免疫印迹和质谱技术筛选子宫内膜异位症标志物

目的:寻找子宫内膜异位症标志物。方法:提取子宫内膜异位症和非内膜异位症子宫在位内膜总蛋白后,用双向电泳技术进行分离,Phoretix2D软件分析凝胶图像,经数据库查询初步鉴定差异表达蛋白质。卵巢子宫内膜异位症(巧克力囊肿)组织总蛋白双向电泳后转膜,用患者血清和正常血清作为一抗行Westernblot检测,比较杂交蛋白点的差异,取差异点用MALDI-TOF-MS分析,根据其肽质量指纹图谱进行数据库查询,鉴定抗原。结果:经优化条件,获得了内膜异位症和对照组的在位内膜总蛋白分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,并分析出11个差异点。利用Westernblot方法比较正常人血清和患者血清与子宫内膜异位症总蛋白的杂交点,取其中3个差异点测质谱分别为波形蛋白、β-肌动蛋白、ATP合成酶β亚单位。结论:子宫内膜异位症在位内膜蛋白质表达谱与非内膜异位症者相比发生了变化,抗子宫内膜抗体可能针对波形蛋白、β-肌动蛋白、ATP合成酶β亚单位而产生。

应用双向电泳、免疫印迹和质谱技术筛选乳腺癌相关抗原

目的:筛选乳腺癌相关抗原。方法:提取乳腺癌T-47D细胞株总蛋白,采用双向电泳技术进行分离后转膜,分别采用乳腺癌患者血清和对照血清作为一抗进行Western blot分析,比较杂交蛋白点的差异,取差异蛋白点行液相色谱串联质谱分析并通过数据库查询,鉴定抗原。结果:筛选出10个差异蛋白,取其中3个仅与乳腺患者血清反应的蛋白行质谱分析显示,这3个蛋白分别为脯氨酰-4-羟化酶β亚基、人类真核翻译延伸因子1γ、磷酸甘油酸变位酶1。结论:成功鉴定了3个可能的乳腺癌相关抗原。

微小RNA-199a-5p保护大鼠脑缺血后血-脑屏障完整性

目的探讨微小RNA(miR)-199a-5p保护脑缺血后血-脑屏障(BBB)完整性的机制。方法通过SPF级成年雄性SD大鼠建立永久性大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,48只大鼠随机分为假手术组、模型组、MCAO+miR-199a-5p组和MCAO+miR-199a-5p阴性对照组,每组12只。应用Ludmila Belayev 12分评分法评估大鼠的神经行为学表现;采用Evans蓝染色检测脑缺血后BBB的完整性;免疫荧光染色检测脑缺血后细胞凋亡;Western blotting技术检测claudin-5、磷脂酰肌醇-3激酶调节亚基2(PIK3R2)、p-Akt、Akt和血管内皮生长因子(VEGF)-A的蛋白表达;利用Real-time PCR检测脑缺血半暗带、梗死区miR-199a-5p、claudin-5及VEGF-A表达水平。结果MiR-199a-5p mimic干预增强MCAO大鼠本体感觉和运动能力。MiR-199a-5p降低脑缺血后PIK3R2的表达,激活Akt信号通路,并增加缺血半暗带中claudin-5和VEGF-A的表达。此外,miR-199a-5p减轻了脑缺血后的炎症。MiR-199a-5p降低脑缺血后BBB渗透性,减少神经细胞凋亡。结论MiR-199a-5p可降低缺血性脑卒中后PIK3R2的表达,激活Akt信号通路,降低炎性细胞因子的表达,减轻缺血性脑卒中对BBB的破坏。

慢病毒载体介导的类固醇生成因子-1沉默调控子宫内膜基质细胞蜕膜化与自噬

目的探讨慢病毒载体介导的类固醇生成因子-1(SF-1)沉默对人子宫内膜基质细胞(hESCs)蜕膜化进程的影响及机制。方法收集子宫内膜异位症(EM)患者与正常妊娠者的子宫内膜组织,通过Real-time PCR和免疫组织化学染色检测SF-1的差异表达情况。从正常妊娠者的子宫内膜组织中分离并鉴定hESCs,将hESCs分为对照组、雌二醇(E_(2))+孕酮(P4)组、短发夹RNA(shRNA,sh)-正常对照(NC)+E_(2)+P4组、sh-SF-1+E_(2)+P4组,进行对应处理后,倒置显微镜下观察hESCs形态变化,Real-time PCR和Western blotting分别检测细胞内人胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)、泌乳素(PRL)的mRNA表达水平和蛋白表达水平,流式细胞术测定细胞周期分布,免疫荧光染色观察细胞内自噬标记物微管相关蛋白轻链3(LC3)表达情况,Western blotting测定细胞内自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin-1表达水平。结果EM患者子宫内膜组织中SF-1 mRNA相对表达量和SF-1蛋白阳性率均高于正常妊娠者子宫内膜组织(P<0.05)。与sh-NC+E_(2)+P4组比较,sh-SF-1+E_(2)+P4组细胞多为长梭形,未见明显蜕膜化,IGFBP1、PRL的mRNA相对表达量与蛋白相对表达量均显著下调(P<0.05),G_(0)/G_(1)期细胞比例显著减少而S期细胞比例显著增加(P<0.05),细胞内LC3荧光表达增强,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著升高,Beclin-1蛋白相对表达量也显著上调(P<0.05)。结论EM患者子宫内膜组织内SF-1表达升高,通过慢病毒载体介导的SF-1沉默能够抑制hESCs蜕膜化过程,该作用可能与调控细胞自噬水平相关。

N6-甲基腺苷甲基化相关因子在小鼠骨骼肌损伤修复中的表达及机制

目的探讨N6-甲基腺苷(m6A)甲基化相关因子在骨骼肌损伤后修复过程中的时间动态表达及其对损伤过程中巨噬细胞炎症反应的调控作用。方法建立BaCl2损伤小鼠腓肠肌模型,对照组和损伤组每组4只小鼠。分别于小鼠损伤后第1、3、5、7、9天取腓肠肌组织进行实验;分离培养原代腓肠肌肌组织细胞,肌卫星细胞,肌细胞和培养成肌细胞系C2C12细胞,添加地塞米松(DEX,50μmol/L)处理细胞模拟损伤;脂多糖(LPS,100μg/L)处理巨噬细胞系RAW264.7细胞模拟骨骼肌损伤后的炎症反应,LPS处理前添加STM2457(30μmol/L)抑制m6A甲基转移酶3(Mettl3)的作用。利用Real-time PCR和Western blotting方法检测m6A甲基化相关因子(Writers,Erasers,Readers)的表达和炎症因子的表达。结果肌纤维随着损伤时间的延长,出现溶解后逐渐修复,单核/巨噬细胞数量先增加后减少,配对盒7(Pax7)mRNA水平随着损伤时间的变化先升高后降低。与对照组相比,腓肠肌中的m6A甲基化相关因子的mRNA水平和蛋白水平在损伤第1天时变化不显著,到损伤第3天显著升高(P<0.05);损伤后第5天与第3天相比显著下降(P<0.05);损伤后第7天和第9天与对照组相比差异无显著性。DEX降低了原代肌卫星细胞和C2C12细胞m6A甲基转移酶因子的mRNA表达水平(P<0.05),升高了甲基化识别酶因子的mRNA表达水平(P<0.05)。骨骼肌肌组织细胞和肌细胞中m6A甲基化相关因子的mRNA水平在DEX处理后均显著升高(P<0.05)。LPS导致巨噬细胞中m6A甲基化相关因子的mRNA和蛋白水平及炎症因子白细胞介素(IL)-6和IL-1β的mRNA表达水平显著升高(P<0.05),而抑制Mettl3之后,巨噬细胞炎症因子mRNA水平显著下降(P<0.05)。结论m6A甲基化相关因子在受损的肌细胞和巨噬细胞炎症反应中被激活,抑制m6A甲基转移酶能够减弱巨噬细胞炎症反应。

灯盏乙素通过环状GMP-AMP合酶-干扰素基因刺激因子通路抑制BV-2小胶质细胞介导的神经炎症

目的探讨灯盏乙素对脂多糖(LPS)诱导的BV-2小胶质细胞神经炎症的影响。方法培养BV-2小胶质细胞系,将BV-2小胶质细胞分为对照组(Ctrl)、环状GMP-AMP合酶(cGAS)抑制剂RU320521(RU.521)组、LPS组、LPS+RU.521组、LPS+灯盏乙素预处理(LPS+S)组、LPS+S+RU.521组,共6组。Western blotting及免疫荧光双标染色法检测并观察BV-2小胶质细胞中cGAS、干扰素基因刺激因子(STING)、核因子κB(NF-κB)、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)、PYD结构域蛋白3(NLRP3)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达变化(n=3)。结果Western blotting和免疫荧光双标染色均显示,与对照组相比,LPS诱导后,BV-2小胶质细胞中cGAS、STING、p-NF-κB、NLRP3和TNF-α蛋白的表达水平显著升高(P<0.05);与LPS组相比,LPS+S组中cGAS、STING、p-NF-κB、NLRP3和TNF-α蛋白的表达水平显著下降(P<0.05)。使用cGAS通路抑制剂RU.521后显示了与灯盏乙素预处理组相似的作用效果。此外,NF-κB在各组的变化不明显(P>0.05)。结论灯盏乙素干预抑制BV-2小胶质细胞介导的神经炎症反应,可能与cGAS-STING信号通路有关。

酶联免疫电转移印迹技术在囊尾蚴病诊断中的应用

目的 应用高度敏感、特异的酶联免疫电转移印迹技术 (EITB)诊断囊尾蚴病。 方法 用双向电泳法对囊液抗原进行分离、纯化 ,并通过免疫印迹 ,用囊尾蚴病患者、棘球蚴病患者和其他异源血清筛选高免疫反应性和高特异性抗原组分 ,以此建立EITB诊断方法 ,与传统的ELISA法相比 ,并比较血清和滤纸干血浸出液两种样本的敏感性。 结果 得到了等电点为 9.4,相对分子质量为 14 0 0 0和 1660 0两组特异性抗原组分 ,以此为诊断抗原建立了EITB诊断方法 ,其敏感度和特异度分别高达 92 .5 %和 10 0 % ,显著高于ELISA法。在EITB中血清和滤纸干血浸出液的敏感性相似。 结论 EITB诊断囊尾蚴病较ELISA法敏感性高。

益气活血法对脑出血大鼠脑内凝血酶敏感蛋白-1及其受体CD36表达的影响

目的通过观察益气活血法对脑出血大鼠脑内损伤区凝血酶敏感蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1)及其受体CD36表达的影响,初步探讨益气活血法治疗脑出血的机制。方法将155只SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、益气活血组、益气组和活血组;用Ⅶ型胶原酶诱导脑出血大鼠模型,再对相应的组分别灌服补阳还五汤及该方的益气药组和活血药组,在不同的时间点取脑组织并用免疫印迹(Western-blotting)分析鼠脑TSP-1及CD36的表达。结果正常组和假手术组不同时间点TSP-1和CD36表达无明显变化。模型组TSP-1在脑出血后4 d达高峰,CD36分别在脑出血后4、28 d达高峰。益气活血组1 d TSP-1表达低于模型组(P<0.01),4 d TSP-1和CD36表达均低于模型组(P<0.01),28 d CD36表达高于模型组(P<0.01)。结论益气活血法有可能通过影响脑出血后损伤区TSP-1及其受体CD36的表达,降低其对血管新生的抑制作用,促进新生血管成形、成熟和脑组织修复。

华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶重组蛋白的纯化、酶学活性及免疫学研究

目的体外制备华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶重组蛋白(CsGAPDH),分析其酶学活性及免疫学特性。方法常规表达重组质粒pGEX-4T-1-GAPDH,用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)亲和纯化试剂盒纯化重组蛋白,经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),用凝血酶和纯化柱酶切、纯化的CsGAPDH免疫BALB/c小鼠,制备抗血清。ELISA检测抗IgG抗体滴度,浓缩型S-P免疫组化3步法检测CsGAPDH抗原在免疫小鼠体内的分布和表达。蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其抗血清的特异性。建立酶反应体系测定重组蛋白CsGAPDH的酶催化活性。结果纯化蛋白样品呈单一条带。免疫动物获取CsGAPDH抗血清,在免疫过程中抗体滴度呈连续上升趋势。CsGAPDH抗原分布和表达于小鼠肌细胞膜部位。免疫小鼠血清具有抗CsGAPDH特异性抗体。重组蛋白CsGAPDH具有酶生理活性,其酶活力单位为2 872 U min-1.ml-1。结论制备的重组蛋白CsGAPD H具有较好的酶活性和免疫原性。

益气活血法对脑出血大鼠脑内凝血酶敏感蛋白-2表达的影响

目的观察益气活血法对脑出血大鼠脑内损伤区凝血酶敏感蛋白-2(TSP-2)的影响,探讨益气活血法治疗脑出血的机制。方法SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、益气活血组、益气组和活血组;采用Ⅶ型胶原酶诱导大鼠脑出血模型,再对相应的组分别灌服补阳还五汤及该方的益气药和活血药,在不同的时间点取脑组织并用免疫印迹分析鼠脑TSP-2的表达。结果正常组和假手术组不同时间点TSP-2表达无明显变化;模型组TSP-2在脑出血后1d即开始表达,1～7d各时间点表达无明显差异,7～28d表达呈逐渐上升趋势,并在28d达高峰;益气活血组TSP-2表达14～21d时上升趋势较其它三组缓慢,在21d表达较其它三组弱,在28d表达较其它三组强。结论益气活血法有可能通过影响脑出血后损伤区TSP-2的表达,在受损脑组织进行血管重建的阶段,抑制TSP-2的表达,降低其对血管新生的抑制作用,延长血管新生的时间,并在血管重建后期上调TSP-2表达,抑制血管过度增殖,以保证整个血管新生过程的顺利和效率。

用双向电泳及蛋白质印迹技术筛选乳腺癌相关抗原

目的:应用双向电泳及免疫印迹技术分析乳腺癌MCF-7细胞总蛋白,寻找乳腺癌相关抗原。方法:提取乳腺癌MCF-7细胞总蛋白,双向电泳技术(2-DE)对总蛋白进行分离后转膜,将健康人血清(对照组)和乳腺癌患者血清(实验组)作为一抗进行蛋白质印迹(Western blotting)分析,寻找杂交蛋白点的差异。结果:MCF-7总蛋白双向电泳考马斯亮蓝染色图谱共检测到248个蛋白质斑点,Western blotting显示实验组抗原抗体反应点23个,对照组为13个,找到10个差异蛋白点。结论:乳腺癌患者血清中的抗体表达水平有改变,这10个差异蛋白点有可能是乳腺癌相关抗原。

N-甲基-D-天冬氨酸受体-丝裂原活化蛋白激酶信号通路对心脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的调控作用及其机制

目的探究N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体-丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路对心脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的调控作用及其机制。方法选择健康SD大鼠40只,采用随机数字表法将其分为对照组、心脏骤停/复苏组、地卓西平马来酸盐(MK801)干预组、MEK特异性抑制剂(U0126)干预组、联合干预组,每组各8只。除对照组外,其余组大鼠建立心脏骤停-心肺复苏模型,在复苏72 h取各组血样本进行血清白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、肌酸激酶(CK)活性、丙二醛(MDA)测定,并测定各组大鼠脑梗死面积占比、心肌细胞凋亡率以及脑组织和心肌组织的N-甲基-D-天门冬氨酸受体1(NMDAR-1)、p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)、磷酸化氨基末端蛋白激酶(p-JNK)、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)蛋白表达情况。结果心脏骤停/复苏组的脑梗死面积占比、心肌细胞凋亡率高于对照组、MK801干预组、U0126干预组、联合干预组,差异有统计学意义(P<0.05)。联合干预组的脑梗死面积占比、心肌细胞凋亡率低于MK801干预组、U0126干预组,差异有统计学意义(P<0.05)。联合干预组复苏72 h后的血清IL-1β、TNF-α、CK-MB、MDA低于MK801干预组、U0126干预组、心脏骤停/复苏组,差异有统计学意义(P<0.05)。联合干预组复苏72 h后的心肌组织、脑组织NMDAR1、p38MAPK、p-JNK、p-ERK蛋白表达低于MK801干预组、U0126干预组、心脏骤停/复苏组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论NMDA受体-MAPK信号通路可能参与介导心脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的调控过程,其机制是通过调节机体炎症反应实现的。

新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白的可溶性超表达与免疫活性检测

目的检测新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量,及其免疫活性。方法采用融合表达的方法将HN蛋白基因分别与Grifin、谷胱甘肽S移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Nus A、小泛素样相关修饰物(SUMO)、硫氧还蛋白(thioredoxin)、蛋白G(protein G)、γ-晶状体蛋白(γ-crystallin)、Ars C、Ppi B 10种融合标签基因采用柔性接头进行连接,构建10个重组表达质粒,经酶切及测序鉴定正确后,将这10个重组质粒分别转入大肠杆菌BL21中,用不同条件进行诱导表达,经SDS-PAGE检测并选出最佳诱导蛋白表达的条件,筛选出能够显著促进HN蛋白可溶性表达的标签,并用Western blotting对所表达蛋白的含量进行定性分析,同时纯化的重组蛋白用Western blotting和间接ELISA验证其免疫原性。结果成功构建了10个不同融合标签的HN融合蛋白表达载体,筛选出融合标签麦芽糖结合蛋白(MBP)能够显著促进HN蛋白可溶性表达,且Western blotting显示所表达重组蛋白的表达量是最多的。经Western blotting和间接ELISA验证重组HN蛋白具有良好的免疫原性。结论融合标签MBP可以显著提高HN蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量。