双硫仑/铜复合物联合多柔比星对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响

目的检测双硫仑/铜复合物(DSF/Cu)联合多柔比星对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响并探讨其作用机制。方法以浓度5.000、2.500、1.250、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.019、0.009μmol/L的多柔比星及相同浓度梯度的DSF/Cu(Cu2+固定浓度1μmol/L)分别处理HepG2细胞,噻唑蓝(MTT)法计算多柔比星和DSF/Cu对HepG2细胞的半抑制浓度(IC50)。以上述浓度梯度的多柔比星单独及联合0.15μmol/L的DSF/Cu处理HepG2细胞,MTT法分析单用多柔比星及联合DSF/Cu对HepG2细胞增殖的影响,CompuSyn软件计算两药作用的联合指数(CI)。将HepG2肝癌细胞分为未处理组(不添加任何药物)、二甲基亚砜(DMSO)处理组(仅加入与DSF/Cu处理组等量的DMSO)、DSF/Cu处理组(IC50浓度的DSF/Cu处理)、多柔比星处理组(IC50浓度的多柔比星处理)、多柔比星+DSF/Cu处理组(IC50浓度的多柔比星及DSF/Cu联合处理),以流式细胞技术检测各组HepG2肝癌细胞中ALDH+细胞数量的改变,干细胞成球实验检测各组HepG2肝癌细胞成瘤性的改变,蛋白质印迹法(Western blot)检测各组HepG2肝癌细胞中人表皮生长因子受体2(Her-2)、性别决定区Y框蛋白9(SOX9)、c-Myc、LC3-Ⅱ/Ⅰ和裂解的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(cleaved PARP)蛋白的表达。组间两两比较采用配对样本t检验,组间多个均数比较采用单因素方差分析。结果多柔比星和DSF/Cu对HepG2肝癌细胞作用48 h的IC50分别为0.8698、0.5538μmol/L。多柔比星联合0.15μmol/L的DSF/Cu对HepG2肝癌细胞的增殖抑制作用明显强于单用多柔比星(t=8.930,P<0.01),CompuSyn分析显示多柔比星联合DSF/Cu对HepG2肝癌细胞的增殖抑制呈协同作用(CI<1)。流式细胞分析显示,DSF/Cu处理组[(0.886±0.082)×10^(5)]和多柔比星处理组[(1.374±0.041)×10^(5)]HepG2肝癌细胞中ALDH+细胞数量低于未处理组[(1.859±0.979)×10^(5)],差异有统计学意义(t=10.800、6.444,P<0.05)。多柔比星+DSF/Cu处理组[(0.306±0.122)×10^(5)]HepG2肝癌细胞中ALDH+细胞数量明显低于DSF/Cu处理组和多柔比星处理组,差异有统计学意义(t=5.590、11.730,P<0.01)。干细胞成球实验显示,DSF/Cu处理组(2.167±1.169)和多柔比星处理组(21.170±4.875)中HepG2肝癌干细胞球体数量少于未处理组(46.500±5.357),差异有统计学意义(t=19.800、8.567,P<0.05)。多柔比星+DSF/Cu处理组(0.833±0.753)中HepG2肝癌干细胞球体数量少于多柔比星处理组(21.170±4.875),差异有统计学意义(t=10.100,P<0.01)。而与DSF/Cu处理组(2.167±1.169)比较,多柔比星+DSF/Cu处理组(0.833±0.753)干细胞球体数量差异无统计学意义(t=2.349,P>0.05)。Western blot结果显示,DSF/Cu处理组和多柔比星+DSF/Cu处理组HepG2肝癌细胞中Her-2、SOX9、c-Myc蛋白的表达低于未处理组(0.132±0.013比0.049±0.010比0.950±0.052、0.325±0.049比0.311±0.038比0.922±0.027、0.308±0.041比0.235±0.027比0.816±0.092,F=412.50、113.20、47.54,P<0.05),而LC3-Ⅱ/Ⅰ和Cleaved PARP蛋白表达高于未处理组(1.527±0.201比2.629±0.224比0.766±0.159、0.906±0.083比0.834±0.058比0.039±0.001,F=35.15、170.40,P<0.05)。多柔比星处理组HepG2肝癌细胞中Her-2和SOX9蛋白的表达低于未处理组(0.275±0.018比0.950±0.052、0.535±0.034比0.922±0.027,t=17.440、12.680,P<0.05),但c-Myc、LC3-Ⅱ/Ⅰ和Cleaved PARP蛋白的表达与未处理组比较差异无统计学意义(0.914±0.097比0.816±0.092、1.329±0.152比0.766±0.159、0.063±0.017比0.039±0.001,t=1.042、4.205、2.061,P>0.05)。多柔比星+DSF/Cu处理组中c-Myc、Her-2和SOX9蛋白的表达低于多柔比星处理组(0.235±0.027比0.914±0.097、0.049±0.010比0.275±0.018、0.311±0.038比0.535±0.034,t=9.579、15.520、6.222,P<0.05),而LC3-Ⅱ/Ⅰ和Cleaved PARP蛋白表达高于多柔比星处理组,差异有统计学意义(2.629±0.224比1.329±0.152、0.834±0.058比0.063±0.017,t=6.800、17.980,P<0.05)。结论双硫仑/铜复合物联合多柔比星能够协同抑制HepG2肝癌细胞的增殖,其机制可能与抑制HCSCs及干性基因相关蛋白并诱导肝癌细胞发生自噬和凋亡有关。