家蝇幼虫双翅肽MdDpt I成熟肽基因的克隆与原核表达

对鸡沙门氏菌诱导家蝇幼虫构建的抑制性消减文库(SSH)中筛选得到的家蝇双翅肽I(Musca domesticaDiptericin I,MdDptI)基因进行克隆、表达,并对表达产物的抑菌活性进行初步研究。以沙门氏菌诱导家蝇幼虫cDNA为模板,采用cDNA末端快速扩增技术(RACE),对MdDptI基因进行扩增,并对扩增产物进行测序和生物信息学分析,进一步去掉信号肽并构建重组表达质粒pET-28a-MdDptI,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。借助亲和纯化获得目的蛋白,并验证目的蛋白的生物活性。MdDptI基因全长为419 bp,包含一个300 bp的完整开放阅读框(ORF),编码99个氨基酸,其cDNA序列与GenBank中登录号为FJ794602.1的家蝇双翅肽基因同源性为95%。构建了家蝇MdDptI基因的成熟肽原核表达质粒pET-28a-MdDpt-I,并获得成功表达,表达产物约为12 ku,与预期结果一致。纯化后的目的蛋白表现出一定的抑菌活性。本试验获得了MdDptI基因的全长序列,构建了原核表达载体,并成功获得表达纯化。

家蝇抗菌肽Diptericin基因的克隆与分析

Diptericin是抗菌肽家族中的一员,在昆虫先天免疫系统中起着重要作用。本研究通过EST序列筛选并结合RACE技术克隆了家蝇Musca domestica的Diptericin基因(Md-Diptericin,MdDpt)cDNA序列,GenBank登录号为FJ794602。其全长410bp,包含一个300bp的完整开放阅读框(ORF),推导的氨基酸序列C端富含甘氨酸,N端富含脯氨酸,同源性分析表明,它与厩蝇Stomoxys calcitrans的Diptericin A mRNA相似性最高(identity=74%)。以邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建的系统关系表明,家蝇Diptericin与其他双翅目昆虫的Diptericin起源于共同的祖先,属于Attain-C超家族(Attacin_C superfamily)。基因定量分析表明,大肠杆菌刺激后6～12h,家蝇幼体MdDpt表达出现明显上调。结果提示MdDpt基因在家蝇免疫防御过程中起着重要作用。