用于研究人凝血因子Ⅷ重链抗原表位的双色荧光免疫印迹分析法

目的:寻找更简便精确的方法来检测人凝血因子Ⅷ的抗原表位。方法:采用PCR技术从人凝血因子Ⅷ的克隆载体pENTR223.1/FⅧ上克隆出FⅧ重链(FⅧ-N)的cDNA。将cDNA插入原核载体pET21 a构建重组表达载体pET21 a-FⅧ-N,并转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达H is-FⅧ-N融合蛋白。以表达产物免疫BALB/c小鼠,制备小鼠抗FⅧ-N的抗血清。接着在重组表达载体pET21 a-FⅧ-N中引入内参F lagotag。对FⅧ-N进行定点突变,构建两个突变克隆N1和N2,对二者以及原FⅧ-N进行双色荧光免疫印迹分析。用双色红外激光成像系统进行扫描和定量分析,以绿荧光与红荧光的光密度比值表示突变克隆抗原性的大小。结果:双色荧光免疫印迹分析表明,突变克隆N1,N2的抗原性与原FⅧ-N相比均有显著下降(P<0.05)。FⅧ A2区的三个氨基酸残基Arg484,Arg489,Arg593对FⅧ-N抗原性起着重要的作用。结论:成功建立了人凝血因子Ⅷ重链抗原表位检测的双色荧光免疫印迹分析法。