食品中副溶血性弧菌toxR和tdh基因双色荧光PCR检测方法的建立

目的建立对副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)特异性检测toxR(跨膜转录激活蛋白)基因和tdh(热稳定性直接溶血素)毒力基因的Taqman探针双色荧光PCR检测方法。方法根据副溶血性弧菌toxR基因和tdh基因,分别设计引物和探针,建立Taqman探针双色荧光PCR扩增体系,进行特异性、灵敏度试验;对副溶血性弧菌分离菌株实施检测,了解其tdh基因和tdh基因分布情况。结果结果表明,副溶血性弧菌标准菌株和3株从食物中毒患者中分离获得的分离株均出现toxR基因和tdh扩增曲线,而溶藻弧菌、单增李斯特菌等31株弧菌属其他菌株和肠杆菌科的菌株未见扩增曲线。从食品中分离的37株副溶血性弧菌分离株均未携带tdh毒力基因。副溶血性弧菌检测灵敏度可达到3.6×102cfu/mL。结论该方法可用于同时检测食品中副溶血性弧菌的特异性和毒力基因。

食源性MRSA双色荧光PCR检测方法建立

目的建立快速检测食源性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)Taqman探针双色荧光PCR方法。方法根据金黄色葡萄球菌种属鉴定nuc基因和MRSA决定因子mec A基因,设计合成引物探针,建立双色荧光PCR扩增体系。利用所建立的方法检测特异性及灵敏度。将金黄色葡萄球菌依次传代培养,检测不同代次的菌株验证方法的稳定性,并对实际样品分离株进行检测验证方法的可行性与实用性。结果该方法可准确并特异性检测出MRSA和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-susceptible Staphylococcus aureus,MSSA),检测MRSA的nuc基因和mec A基因的灵敏度可达2.7×103 CFU/m L,不同代次的菌株的检测结果一致。结论本实验所建立的双色荧光PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏度及稳定性,可用于快速检测食源性MRSA。

双色荧光定量PCR快速诊断唐氏综合征

目的建立快速诊断唐氏综合征的荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法及其应用于产前诊断唐氏综合征的可能性。方法合成21号染色体单拷贝基因DSCR1特异的引物和TaqMan探针以及1对非21号常染色体单拷贝基因GAPDH特异的引物和TaqMan探针,其中检测DSCR1基因的探针标记6-羧基荧光素(FAM),检测GAPDH基因的探针标记六氯(HEX)荧光素;提取患者和正常人外周血及胎儿羊水脱落细胞标本的DNA为模板,在同一PCR扩增管中同时进行2种基因的双色荧光定量聚合酶链反应(the double chromatogra-phy fluorescence quantitative polymerase chain reaction,DC-FQ-PCR),分别定量测定DSCR1基因和GAPDH基因的含量,并计算每个标本2种基因剂量的比值;采用该基因检测技术检测23例唐氏综合征患者、20名正常人和100例羊水,与染色体检查诊断结果对比,判断该技术在唐氏综合征基因诊断和产前诊断中的应用价值。结果在30μL FQ-PCR反应体系中,加入最少约0.05 ng基因组DNA能够稳定地获得扩增曲线;实验表明23例染色体检测为唐氏综合征患者的GAPDH与DSCR1的差值为0.65±0.17,以2-△CT方法计算DSCR1与GAPDH拷贝数的比值范围为1.77～1.39。而20例染色体检测为正常人的GAPDH与DSCR1的差值为0.06±0.18,计算DSCR1与GAPDH拷贝数的比值范围为1.18～0.92;2组间的差异有统计学意义。在100例羊水细胞的检测中,以DSCR1与GAPDH拷贝数的比值大于1.35为唐氏综合征的判定标准,发现2例为患儿,其余98例为正常,与染色体检查结果一致。结论双色荧光定量PCR检测唐氏综合征是一个可行的、快速的、准确的、高通量的、费用较为低廉的检测方法,该法在唐氏综合症的基因诊断和产前基因诊断具有广阔的应用前景。

双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案快速筛查肠道传染病菌

目的:采用双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案快速筛查检测公共场所从业人员肠道传染病菌,并与经典的培养法比较,探讨该方法的可行性。方法:随机采集5000份从业人员的肛拭子标本,分别采用双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案和"金标准"培养法同时检测肠道沙门和志贺菌,比较两种方法检测结果之间的差异。结果:双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案的灵敏度为100%,特异性为99.64%,同培养法相比,具有省时、省力、操作安全、成本接近等优点,两种检测方法的阳性率无显著性差异。结论:提示双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案可做为从业人员肠道传染病菌快速筛查的技术方法。

苇状羊茅内生真菌与多年生黑麦草内生真菌实时荧光PCR检测研究

苇状羊茅内生真菌Neotyphodium coenophialum和多年生黑麦草内生真菌N．lolii对美国、新西兰等国家的畜牧业曾经造成过巨大损失。以N．coenophialum和N．lolii及其近似种N．huerfanum、N．chisosum、N．aotearoae、N．sp．共6种18个菌株,以及苇状羊茅和多年生黑麦草8个品种种子为供试材料,根据Tub-2基因设计了通用Taqman探针及引物,根据NC25基因设计了N．coenophialum和N．lolii的特异Taqman探针及共用引物,通过通用探针的单色荧光PCR和特异探针的双色荧光PCR,建立了N．coenophialum和N．lolii的菌丝及单粒种子稳定可靠、特异性强的荧光PCR检测方法,检测灵敏度达到单粒种子,使检测时间由至少一个月缩短至7～8个小时。

沙门菌和志贺菌双重实时荧光定量PCR的应用效果评价

目的研究沙门菌和志贺菌双色实时荧光PCR法的应用价值。方法收集2017年8月到2018年4月深圳市西丽人民医院临床肛拭子样本2700份,运用双色实时荧光PCR法检测沙门菌与志贺菌,统计阳性检出率,并与培养法的检测结果进行对比。结果2700份样本中,培养法检出沙门菌与志贺菌阳性分别为2株、0株,检出率分别为0.07%、0.00%,双色实时荧光PCR法检出沙门菌与志贺菌阳性分别为6株、3株,检出率分别为0.22%、0.11%,双色实时荧光PCR法检出率高于培养法,对比差异有统计学意义(P<0.05)。结论双色实时荧光PCR法检测沙门菌和志贺菌的临床效果显著,具有较高的特异性、敏感度及准确率,值得临床推广与应用。

双色实时荧光PCR法快速检测感染性腹泻人群中的沙门菌和志贺菌

目的调查沙门菌和志贺菌在南京市腹泻人群中的分布情况,为做好防治工作提供资料。方法对监测哨点医院腹泻患者的粪便样本提取核酸,采用双色实时荧光PCR方法对携带SsaR毒力基因的沙门菌属和携带Ipah毒力基因的志贺菌属进行检测,阳性样本再采用传统分离培养方法进行分离,获得的可疑菌株采用ATB生化鉴定,血清凝集确认血清型,从而了解这2种病原菌在腹泻人群中的检出率和相应菌型的分布情况。结果在检测的1 558份样本中,检出沙门菌25株,检出率为1.60%;志贺菌9株,检出率为0.58%。结论本市2012年-2013年肠道门诊腹泻中,分离志贺菌属以福氏志贺菌为主,宋内志贺菌次之,无鲍氏志贺菌和痢疾志贺菌。沙门菌属以D群和C1群血清型为相对优势血清型,血清型分布较广。

BCR/ABL融合基因表达检测技术建立及其初步应用

目的建立BCR/ABL融合基因表达定量分析的双色荧光定量PCR技术;探讨所建立的双色荧光定量PCR技术在CML早期诊断中的临床应用特点。方法据BCR/ABL融合基因序列,设计合成BCR/ABL融合基因及ABL基因特异的引物TaqM an探针。提取患者骨髓细胞标本总RNA,逆转录成cNDA;在同一PCR反应管中同时进行两种基因的双色荧光定量PCR反应,分别定量测BCR/ABL融合基因和ABL基因的表达量,并计算两种基因表达的比值。检测标本中两种基因的表达量,计算检测的阳性率,所得结果与临床诊断结果对比,以判断该技术在CML检测诊断中的价值。结果成功地建立了BCR/ABL融合基因检测的双色荧光定量PCR技术方法;在35例临床CML患者中,33例检出融合基因阳性,检测阳性率94.3%;12例正常人cDNA均未检出融合基因阳性。结论所建立的BCR/ABL融合基因检测的双色荧光定量PCR是一种快速、准确、高通量而费用又较为低廉的基因检测技术,该技术检测CML具有临床可行性。

BCR/ABL融合基因表达检测技术建立及其初步应用

目的:建立BCR/ABL融合基因表达定量分析的双色荧光定量PCR技术;探讨所建立的双色荧光定量PCR技术在CML早期诊断中的临床应用特点。方法:据BCR/ABL融合基因序列,设计合成BCR/ABL融合基因及ABL基因特异的引物和TaqMan探针。提取患者骨髓细胞标本总RNA,逆转录成cDNA;在同一PCR反应管中同时进行两种基因的双色荧光定量PCR反应,分别定量测定BCR/ABL融合基因和ABL基因的表达量,并计算两种基因表达的比值。检测标本中两种基因的表达量,计算检测的阳性率,所得结果与临床诊断结果对比,以判断该技术在CML检测诊断中的价值。结果:成功地建立了BCR/ABL融合基因检测的双色荧光定量PCR技术方法;在35例临床CML患者中,33例检出融合基因阳性,检测阳性率94.3%;12例正常人cDNA均未检出融合基因阳性。结论:所建立的BCR/ABL融合基因检测的双色荧光定量PCR是一种快速、准确、高通量而费用又较为低廉的基因检测技术。