甜橙转录因子CsGRF04转录激活活性分析

生长调节因子(Growth-regulating factor,GRF)是一类植物特有的转录因子,在植物生长发育、激素信号转导、逆境胁迫响应等多个生物学进程中均发挥重要作用.前期研究在对甜橙GRF家族进行全基因组挖掘与逆境胁迫下表达模式分析的基础上,筛选出一个在多重激素和非生物胁迫处理下均显著诱导上调的关键基因CsGRF04.为了进一步验证CsGRF04的转录激活活性,利用酵母系统与双荧光素酶活性分析(LUC)实验分别进行分析.结果表明,CsGRF04在酵母系统中无法激活报告基因表达从而使酵母细胞在缺陷培养基中正常生长,但在LUC系统中能够显著抑制双荧光素酶活性,说明CsGRF04是一个典型的转录抑制因子.为后续深入研究CsGRF04基因在甜橙抗逆响应中的功能奠定了基础.

中国部分汉族人群GH1基因启动子区单核苷酸多态性与正常人群身高的关系

目的研究中国部分汉族人群GH1基因启动子近侧区域内的单核苷酸多态性(SNP)与人体身高调控的关系。方法采用直接测序法进行SNP检测,Logistic回归分析筛查可能与身高相关的基因多态性位点。分别构建所发现的GH1基因启动子区的-308T和-57G突变位点的pGL4荧光素酶报告基因载体,转染入GC细胞后进行双荧光素酶检测分析。结果中国部分汉族人群GH1基因启动子近侧区域中存在12个SNP,有6个位点多态性的发生频率与白种人存在明显差异(P<0.01)。荧光素酶检测结果示野生型荧光表达量高于-57和-308位点突变型,差异有统计学意义(P<0.01)。结论GH1基因启动子邻近区域在中国部分汉族人群中表现出高度多态性,并存在一定的人种差异,其中有两处SNP可能影响到人群的身材高矮。

ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序列转录活性的鉴定

目的检测ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序列的转录活力,探讨ezrin基因在癌细胞的表达调控机制。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法检测ezrin基因在食管癌细胞EC109、EC171、EC8712、SHEEC,胃癌细胞N87、BGC823,肺癌细胞A549、95D,肝癌细胞HepG2,白血病细胞K562和宫颈癌细胞HeLa中的mRNA和蛋白表达水平;采用PCR法构建以ezrin基因翻译起始位点上游-1444/+134序列为启动子的真核细胞表达质粒pGLB-hE(-1444/+134);采用双荧光素酶报告基因分析系统检测-1444/+134序列在EC109、Hela、A549和BGC823细胞中的转录活力。结果ezrin基因在食管癌等几种癌细胞中均有高表达,其5′侧翼区-1444/+134序列具有较强的转录活力。结论ezrin基因5′侧翼区序列的转录活性可能对ezrin基因的几种癌细胞中的高表达起重要作用。

肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚.为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58).其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性.最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1(由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体)分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达.研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要.

牛Sry启动子调控序列的鉴定

【目的】Sry是大多数哺乳动物雄性性别发育的决定基因,但人们仍未找到其表达的调控规律,本试验对牛Sry5′端调控序列作了初步的研究,为深入研究牛Sry的表达调控奠定了基础。【方法】克隆牛Sry5′端侧翼1056bp长的DNA序列,利用生物信息学方法对这一区域内潜在的转录起始位点进行了预测,并构建了10个不同长度的缺失牛Sry5′部分侧翼序列的报告基因载体;进一步分离了胎牛生殖嵴,进行生殖嵴细胞的原代培养,并对胎牛生殖嵴细胞进行了性别和特征鉴定;最后利用荧光素酶双报告基因分析系统,在生殖嵴细胞内检测了牛Sry核心启动子区域的位置。【结果】体外培养的生殖嵴细胞可以表达雄性生殖嵴细胞的特征基因Sry、Sox9、Sf-1和Dax1,牛Sry5′端-93、-419和-722处存在3个潜在的转录起始位点(TSS),-599—-565区域35bp内存在控制Sry基础转录活性的顺式调控元件,其中存在多个潜在的转录因子结合位点。【结论】牛Sry5′端UTR区-599—-565bp区域35bp存在部分调控序列。

微小RNA-141-3p在脑出血患者血清中的表达及其作用机制

目的分析微小RNA-141-3p(miR-141-3p)在脑出血(ICH)患者中的表达水平,并探讨miR-141-3p对大鼠脑出血损伤的作用及其机制。方法以40例脑出血患者和40例体检健康对照者为研究对象,采用Real-time PCR方法检测血清中miR-141-3p的含量。采用生物信息学预测miR-141-3p的靶标基因,双荧光素酶报告分析验证miR-141-3p对核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3(NLRP3)的调控作用。在大鼠脑出血模型侧脑室注射miR-141-3p激动剂(agonist)或者激动剂对照(agonist NC),治疗7 d后进行神经功能评分。麻醉处死大鼠后取出脑组织,HE染色观察脑组织病理改变。干湿重法测定脑组织含水量,并采用Real-time PCR测定miR-141-3p和NLRP3的表达,通过Western blotting方法测定白细胞介素(IL)-1β、IL-6和IL-18的表达。结果与健康对照组(0.520±0.028)相比,脑出血患者血清中miR-141-3p的表达水平(0.068±0.038)显著下调(t=15.93,P<0.001),且与血肿周围水肿严重程度成负相关(r=-0.8948,-0.9434~-0.8087,P<0.001)。miR-141-3p靶向调控NLRP3基因表达。miR-141-3p的表达水平在miR-141-3p agonist组中明显高于agonist NC组(P<0.001),炎症小体NLRP3和炎症因子IL-1β、IL-6和IL-18表达水平明显低于agonist NC组(P<0.001)。与agonist NC组相比,agonist组miR-141-3p在ICH术后7 d脑水肿减轻,神经功能评分明显降低(P<0.001)。HE染色结果表明,ICH大鼠注射miR-141-3p激动剂后血肿周围水肿明显缩小。结论miR-141-3p通过靶向NLRP3降低炎症反应,减轻对脑出血后血肿周围脑组织的损伤。

转录因子Sp1和Sp3对食管癌细胞ezrin基因的表达调控作用

目的:明确转录因子Sp1和Sp3对食管癌细胞ezrin基因的表达调控作用。方法:将转录因子表达载体CMV-Sp1和CMV-Sp3分别转染食管癌EC109细胞,采用定量RT-PCR和Western blot技术检测过表达转录因子Sp1和Sp3对ezrinmR-NA和蛋白表达的影响;将ezrin基因启动子驱动的报告基因表达载体与内参照质粒pRL-TK和转录因子表达载体共转染EC109细胞,采用双荧光素酶报告基因分析系统检测转录因子Sp1和Sp3对ezrin基因启动子的激活作用以及这种激活作用是否依赖于ezrin基因的Sp1结合位点-75/-69。结果:过表达转录因子Sp1和Sp3显著提高EC109细胞ezrinmRNA和蛋白表达水平以及启动子活性。Sp1和Sp3增强ezrin基因启动子活性的作用位点不同,只有Sp1通过-75/-69位点调控ezrin基因启动子活性。结论:转录因子Sp1和Sp3可调控EC109细胞ezrin基因的表达。

鼻咽癌细胞中ezrin基因启动子上游序列转录调控特性的研究

目的:研究鼻咽癌细胞中ezrin基因启动子上游序列的转录调控特性。方法:构建一系列携带ezrin基因-1541/-706序列的报告基因表达载体,ezrin基因-1541/-706序列以正向和反向分别连接至不含启动子的报告基因上游、ezrin启动子上游、SV40启动子上游、ezrin启动子或SV40启动子控制的报告基因下游,将质粒转染CNE2细胞,检测荧光素酶活性。结果:CNE2细胞中,当-1541/-706序列正向位于报告基因上游时表现出启动子活性,其转录激活作用约为ezrin启动子的50%;反向连接时无启动子活性。而且,当-1541/-706序列正向位于ezrin启动子或SV40启动子上游时,显著提高荧光素酶表达;当反向位于启动子下游、正向或反向位于启动子控制的报告基因下游时,转录增强作用消失。结论:CNE2细胞中ezrin基因启动子上游序列具有转录激活和转录增强作用,这种作用具有DNA序列位置和方向依赖性。

人SREBP-1c启动子报告基因的构建和功能验证

目的构建人SREBP-1c启动子的荧光素酶报告基因载体并进行功能的初步验证。方法提取人血基因组DNA,PCR扩增SREBP-1c的启动子,构建SREBP-1c启动子双荧光素酶的报告基因载体;用双荧光素酶活性检测其功能。Western blot检测FoxO1对SREBP-1c蛋白的抑制作用。结果成功构建了pGL3-Basic-SREBP-1c-promoter的报告基因载体,共转染FoxO1明显抑制了人SREBP-1c启动子的活性,同时过表达FoxO1抑制了SREBP-1c的蛋白表达。结论FoxO1通过抑制SREBP-1c的转录来抑制SREBP-1c的表达。

食管癌细胞ezrin基因启动子TPA反应性的研究

背景与目的:研究食管癌细胞ezrin基因启动子的TPA反应性以及TPA诱导ezrin基因转录的MAPK信号转导途径。材料与方法:应用转录因子数据库分析预测ezrin基因-87/+134序列的潜在转录因子结合位点和TPA反应元件;采用双荧光素酶报告基因分析系统,检测ezrin基因-87/+134序列的启动子活性和TPA反应性,TPA反应元件结合蛋白Sp1和AP-1对ezrin基因的转录激活作用,以及MAPK抑制剂对TPA诱导激活的ezrin基因转录的抑制作用。结果:ezrin基因-87/+134序列存在潜在TPA反应元件,具有启动子活性;5ng/mlTPA显著增强ezrin基因启动子活性(P<0.01);Sp1和AP-1对ezrin基因具有转录激活作用;MEK1/2特异性抑制剂U0126和PD98059降低TPA诱导的ezrin基因转录激活作用。结论:食管癌细胞中,ezrin基因启动子具有TPA反应性;TPA可能通过MEK/ERK1/2磷酸化Sp1/AP-1途径调控ezrin基因转录。

A型塞尼卡病毒3′非编码区潜在吻环基序突变对微型基因组蛋白表达的影响

A型塞尼卡病毒(Senecavirus A,SVA),可导致猪的口吻部、口腔黏膜、蹄冠部出现水疱样病变,其临床症状与其他水疱型疫病所导致的症状难以区分。该病毒属于小RNA病毒科(Picornaviridae)、塞尼卡病毒属(Senecavirus)成员,其基因组含有5′非编码区(5′untranslated region,5′UTR)、多聚蛋白的开放阅读框及3′非编码区(3′untranslated region,3′UTR)。过去有报道预测该病毒的3′UTR含有一个三碱基配对的潜在RNA吻环结构,但未被试验证实。构建了7个不同吻环基序突变的SVA微型基因组,将其分别与另一荧光报告质粒共转染细胞后,进行双荧光素酶报告分析。结果证明潜在吻环结构的破坏未能干扰5′UTR启动蛋白的表达。

不同细胞中STAT元件对刺激因子的特异性应答

以高通量药物筛选为目的,构建转录因子STAT元件驱动的萤火虫荧光素酶报告载体,并进行功能初步验证.人工合成含IRF-1和C-FOS基因上游调控序列中的2个STAT元件的DNA片段,克隆于pGL3-promoter报道质粒作为报道载体pSTAT-luc;为检测其对不同有效因子刺激的反应性,该报道载体与荧光内参照载体pRL-SV40瞬时共转染不同细胞,在各种因子刺激条件下,双荧光素酶检测系统测定化学发光强度.结果显示,pSTAT-luc的报道基因载体符合预期设计;该载体转染细胞实验显示,在STAT途径阳性的HeLa、A549和MCF-7细胞中,特异刺激因子INF-γ和抑瘤素OSM处理能够剂量依赖性的引起细胞内萤火虫荧光素酶的升高;在STAT途径阴性的PC-12细胞,上述因子不能引起荧光素酶的活性改变;以非该途径因子刺激时,HeLa、A549和MCF-7细胞未见发光水平的改变.结果表明,构建的报道系统具有阳性细胞反应特异性以及阳性刺激-反应特异性,能够用于建立靶向STAT信号通路的高通量药物筛选平台.

miR-205对PEG3在子宫内膜癌细胞系中的靶向降调作用

目的探讨子宫内膜癌细胞系中miR-205对父性表达基因3(PEG3)蛋白的作用。方法免疫组化方法确定PEG3蛋白在正常子宫内膜与高、中、低分化子宫内膜癌组织中表达的差异。RT-PCR筛选出miR-205较正常子宫内膜细胞株表达量高的高、中、低分化子宫内膜癌细胞系,CCK-8及流式细胞学实验检测上调miR-205前后细胞增殖及凋亡;Western blot、RT-PCR和双荧光素酶报告基因分析等实验方法验证miR-205对PEG3是否有直接的靶抑制作用。结果 PEG3蛋白在正常子宫内膜组织中表达明显高于高、中、低分化子宫内膜癌组织。miR-205在高、中、低分化子宫内膜癌细胞系中上调后,细胞增殖促进,凋亡抑制;Western blot结果示PEG3蛋白含量降低,PEG3抑制的WNT通路中的两个关键蛋白β-catenin及c-myc也相应的表达量上调,而RT-PCR结果显示PEG3mRNA含量变化差异无统计学意义;双荧光素酶报告基因分析结果显示miR-205作用于PEG3基因的3’UTR端。结论 MiR-205作用于PEG3基因的3’UTR端,在转录后水平抑制PEG3的表达,提示PEG3是miR-205的直接靶基因。