CXCR4-3’-UTR双荧光素酶报告基因载体的构建及与microRNA-494的靶向作用

目的 构建野生型与突变型CXCR4基因3’-非编码区(3’-UTR)的双荧光素酶报告基因载体,验证microRNA-494 (miR-494)对CXCR4的靶向调控作用。方法 使用生物信息学相关软件预测miR-494与CXCR4之间的靶向关系;利用PCR法扩增CXCR4的目的基因片段构建野生型与突变型CXCR4基因3’-UTR的双荧光素酶报告基因载体;将miR-494模拟物和阴性对照物分别与野生型pMIR-CXCR4-wt-3’-UTR或突变型pMIR-CXCR4-mut-3’-UTR双荧光素酶报告基因载体共同转染NRK-49F细胞,然后进一步检测相对荧光值。结果 成功构建野生型与突变型CXCR4基因3’-UTR的双荧光素酶报告基因载体,荧光结果显示加入miR-494模拟物可使野生型pMIR-CXCR4-wt-3’-UTR的荧光素酶活性降低约52%,但突变型pMIR-CXCR4-mut-3’-UTR的荧光素酶活性与对照组相比无显著变化。结论 初步证实miR-494与CXCR4之间存在靶向调控关系。

基于Golden Gate高效构建psiCHECK双荧光素酶报告基因的方法及应用

目的 基于Golden Gate技术构建psiCHECK-CcdB重组双荧光素酶报告载体,并探讨其能否用于RNA干扰(RNA interference, RNAi)药物筛选。方法 通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增CcdB致死基因、氯霉素基因与Golden Gate组装所需的BsmBI酶切位点,将其克隆至psiCHECK-2载体,构建出重组载体psiCHECK-CcdB。利用2种大肠杆菌DB3.1与DH5α对该载体的致死效率进行检测,选用1 387 bp大小的外源片段克隆至psiCHECK-CcdB载体,检测其连接效率,并验证重组载体能否发挥双荧光素酶报告系统功能,监测目的基因的表达变化。结果 菌落PCR以及测序鉴定psiCHECK-CcdB重组质粒构建成功,该质粒可有效致死无法耐受CcdB毒素的大肠杆菌DH5α菌株,在DB3.1菌株中正常生长。采用Golden Gate的方法可将外源片段简单快速克隆至psiCHECKCcdB载体中,连接效率显著提高且低背景克隆。通过测定双荧光素酶表达强度,证实了小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)靶向性结合目的基因可显著下调荧光素酶的表达,成功发挥双荧光素酶报告基因功能。结论 本研究成功构建了psiCHECK-CcdB重组双荧光素酶报告载体,应用Golden Gate组装技术,简化了实验操作流程,降低了实验成本,具备较高的阳性克隆率与多片段一次性组装的潜力,在RNAi药物筛选领域应用前景广阔。

一种检测蛋白酶活性的荧光素酶报告基因系统的构建及应用

为建立一种检测蛋白酶活性的方法,本研究将IL-1β前体基因和荧光素酶基因融合,克隆至p CAGGS真核载体,构建了基于荧光素酶的报告基因系统(iGLuc),同时构建GLuc真核表达质粒作为对照。以PRRSV nsp4和ASFV S273R蛋白酶为检测对象,利用该报告基因系统对病毒蛋白酶活性进行检测,将iGLuc中蛋白酶酶切位点(FVCDAN)相对应的基因序列替换为Kpn I酶切位点,构建重组质粒Kpn I-iGLuc,然后分别将PRRSV nsp4和ASFV S273R蛋白酶切割位点对应的核酸序列插入至报告基因Kpn I-iGLuc中的Kpn I位点,构建重组质粒nsp4-iGLuc和S273R-i GLuc。分别将报告基因质粒(iGLuc、GLuc、Kpn I-i GLuc、nsp4-i GLuc和S273R-iGLuc)与不同剂量的相应蛋白酶真核表达质粒共转染HEK293T细胞,24 h后检测上清中荧光素酶GLuc的活性。结果显示,转染i GLuc、nsp4-iGLuc或S273R-iGLuc质粒的上清中荧光信号随着相应蛋白酶的剂量增加而升高,呈现剂量依赖性,而缺失蛋白酶切位点的对照质粒无该现象,表明构建的荧光素酶报告基因能够特异性地检测细胞蛋白酶和病毒蛋白酶的活性。本研究首次建立了一种检测蛋白酶活性的方法,并以PRRSV nsp4和ASFV S273R蛋白酶验证了该方法的应用价值,为后续开展高通量化筛选抗PRRSV、ASFV等药物的研究奠定了基础。

TNF-α3′-UTR双荧光素酶报告基因系统的构建及丹参酮类药物筛选

目的构建并鉴定p GL3-TNF-α3'端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因(DLR)表达系统,以此基于调控TNF-α转录后水平对丹参酮类成分进行筛选。方法反转录人脐静脉内皮细胞HUVEC的mRNA成c DNA,以之为模板,PCR扩增含TNF-α3'-UTR的DNA片段全长,经酶切后连接至荧光素酶报告载体p GL3-control上,构建出p GL3-TNF-α3'UTR全长的荧光素酶报告基因载体并进行鉴定。将所构建的p GL3-TNF-α3'UTR与p SVRenilla质粒组成双荧光素酶报告系统共转染至单核巨噬细胞RAW264.7,经脂多糖诱导后利用该双荧光素酶报告基因表达系统判定丹参酮类成分对TNF-α转录后调控是否有影响。结果成功构建p GL3-TNF-α3'UTR荧光素酶报告基因,克隆获得的DNA片段大小及序列与Genbank报道的一致。脂多糖(LPS)可以明显诱导转入p GL3-TNF-α3'UTR载体细胞的荧光强度。丹参酮类成分中隐丹参酮可以明显降低LPS诱导的p GL3-TNF-α3'UTR载体细胞的荧光素酶活性。结论成功构建含TNF-α3'UTR区的双荧光素酶报告基因表达系统,并以此从丹参酮类化合物中筛选出隐丹参酮,可以对TNF-α的转录后水平进行抑制调控。

一种新型双荧光素酶报告基因表达载体的构建

目的:构建一种新型的双荧光素酶报告基因表达载体。方法:设计并扩增海肾荧光素酶基因hRLUC,将其插入到双酶切的含有萤火虫荧光素酶报告基因(Firefly)的载体pGL4.10中,得到pGL4.10-hRLUC;使用lipofectamine3000将pGL4.10和pGL4.10-hRLUC分别转染入HEK293细胞,检测细胞中荧光素酶活性,以未转染细胞作对照。结果:使用PCR方法获得hRLUC表达单元(2 350 bp);双荧光素酶报告基因表达载体pGL4.10-hRLUC经酶切和测序鉴定,插入正确。转染pGL4.10组荧光素酶活性相对值为(220.311±2.082);转染pGL4.10-hRLUC的细胞中荧光素酶活性低于pGL4.10转染细胞,高于未转染细胞(P<0.05)。结论:成功构建了双荧光素酶报告基因(hRLUC和Firefly)表达载体。

双荧光素酶报告基因系统的应用研究进展

双报告基因即在一个信号系统内同时表达,但独立测量的两个荧光酶的报告基因。在双报告基因系统中,一个报告基因活性的改变,与基因表达的特定实验条件相关,而另个报告基因的组成型活性则提供内对照,使实验值正态化。目前很多实验都采用了荧光素酶报告基因(Luc),但从检测速度、灵敏度和线性范围来考虑,双荧光素酶即萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)和海肾荧光素酶(Renilla luciferase)的组合,可以较好地体现检测结果的精确性。本文以萤火虫双荧光素酶报告基因系统为重点,综述了该报告系统的特点、应用和近年来的研究进展。

双荧光素酶报告基因系统检测CYP3A4* 1G增强CYP3A4表达的调控作用

目的:探讨CYP3A4*1G增强CYP3A4基因表达的负调控作用。方法:设计合成包含CYP3A4*1G G或A等位基因的一系列基因片段(外显子10与内含子10交界处287和181 bp),构建CYP3A4*1G正向位于CYP3A4启动子上游的荧光素酶报告基因载体,与内参质粒pRL-TK共转染Hep G2细胞,通过双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。结果:与CYP3A4启动子相比较,G与A等位基因在287 bp DNA片段中均降低了荧光素酶表达(F=795.575,P<0.001),且G与A等位基因对CYP3A4启动子活性的抑制程度比较差异无统计学意义(P>0.05)。与CYP3A4启动子相比较,G与A等位基因在181 bp DNA片段中均降低了荧光素酶表达(F=23.218,P<0.001),而G与A等位基因对CYP3A4启动子活性的抑制程度比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:在CYP3A4内含子10与外显子10交界处CYP3A4*1G存在与CYP3A4*1G变异无关的CYP3A4启动子的抑制元件,该抑制元件对CYP3A4*1G增强CYP3A4基因表达起负调控作用。

双荧光素酶报告基因系统验证hsa-miR-1291对ARHGAP29基因的调控作用

目的验证hsa-miR-1291对ARHGAP29基因的靶向调控作用。方法利用PCR方法,根据目的基因ARHGAP29的3′非编码区(3′untranslated region,3′UTR)序列信息设计扩增引物,以293T细胞基因组DNA为模板,扩增ARHGAP29基因的野生型3′UTR片段(ARHGAP 29-WT 3′UTR)及突变型3′UTR片段(ARHGAP29-MUT 3′UTR),并将其分别克隆到双荧光素酶报告pmiR-RB-Report载体中,构建双荧光素酶基因报告载体,即野生型载体ARHGAP29-WT 3′UTR pmiR-RB-Report和突变型载体ARHGAP29-MUT 3′UTR pmiR-RB-Report。将hsa-miR-1291 mimic、阴性对照(non-target control,NC组)同野生型载体、突变型载体载体分别共转染于293T细胞中,进一步检测相对荧光值。结果成功构建ARHGAP29-WT 3′UTR pmiR-RB-Report载体(野生型载体)、ARHGAP29-MUT 3′UTR pmiR-RB-Report载体(突变型载体)。荧光检测结果显示,野生型载体转染hsa-miR-1291 mimic后,其荧光表达较NC组明显下降(0.67±0.04 vs 1.00±0.08,P=0.014);转染hsa-miR-1291 mimic后,突变型载体的荧光表达相对于野生型载体的荧光表达有所上升(1.20±0.05 vs 0.67±0.04,P<0.001)。结论初步证实hsa-miR-1291很可能对ARHGAP 293′UTR上的该位点有靶向调控作用。

MDR1基因单靶点双荧光素酶报告基因系统的建立

目的通过构建以MDR1启动子为启动序列的双荧光素酶报告基因系统并进行活性分析,为MDR1基因表达的单靶点调控研究和逆转剂的筛选提供一种有效的方法。方法从HCT-8细胞中提取DNA并克隆含有MDR1基因启动子中Y-box序列。将该序列重组到萤光素酶报告基因载体pGL-3-Basic的启动区域中,从而构建报告基因载体pGL-MDR1。将pGL-MDR1和pRL-TK载体共转染到HCT-8和HCT-8/VCR细胞中。通过调节不同载体的比例来优化转染效率。利用MDR1基因激活剂(热诱导)和抑制剂(EGCG)等处理来分析其启动转录活性受外界因素的影响。结果通过直接测序法验证了pGL-MDR1含有MDR1基因启动子Y-box序列且没有出现碱基突变。在pGL-MDR1和pRL-TK的转染比例为5:5时,转染效率最高并具有最高的萤光素酶活性。通过MDR1基因激活处理后表现为时间依赖性地激活MDR1基因的表达,而MDR1基因抑制剂的作用则相反。结论MDR1启动子为启动序列的双荧光素酶报告基因系统建立成功。该系统不但可以用于研究活体生物发光成像和MDR1基因表达的机理,而且可用于单靶点的多药耐药抑制剂的筛选。

基于双荧光素酶报告基因的DNA损伤与修复检测系统的建立与应用

目的:建立一种能够同时对环境致癌物所致HepG2细胞DNA损伤和细胞对损伤DNA的修复能力进行快速检测的系统。方法:5μmol/L氯化镉体外损伤质粒pTK-RL,质粒pgadd153-luc和体外受损的质粒pTK-RL共转染到HepG2细胞中,以16种已知致癌物或3种无遗传毒性的非致癌物刺激细胞,利用双荧光素酶检测方法同时检测DNA损伤和细胞的修复能力;双荧光素酶检测系统检测居民区、垃圾焚烧厂和农田3个不同污染区土壤中非挥发性有机提取物对DNA的损伤作用和细胞对该损伤的修复能力;彗星实验检测DNA的损伤。结果:双荧光素酶报告基因检测系统均可检出已知环境致癌物对DNA损伤与修复能力的影响,非致癌物均未检测到DNA损伤作用和对细胞DNA修复能力的影响;3个不同污染区土壤中非挥发性有机提取物均可诱导DNA损伤并抑制细胞对DNA损伤的修复能力,强度为居民区>垃圾焚烧厂>农田土壤。结论:在本研究条件下建立了可同时检测环境致癌物DNA损伤与细胞修复能力的双荧光素酶报告基因检测系统并可用于环境污染区检测。

人DRD1基因启动子区克隆和双荧光素酶报告基因系统的构建

背景:多巴胺受体启动子区多态性位点的改变会影响受体的表达量,进而影响多巴胺能神经递质的作用,导致相关疾病的发生。目的:通过克隆人DRD1基因的启动子区,构建含有该基因启动子序列的双荧光素酶报告基因载体并检测其活性,为研究DRD1基因的转录调控提供基础工具。方法:以人静脉血基因组DNA为模板,通过PCR扩增DRD1基因启动子序列并克隆至pG M-T载体,测序验证无误后酶切连接至萤火虫荧光素酶报告基因质粒pG L3-Basic,构建含有DRD1基因启动子的荧光素酶报告基因载体,采用阳离子脂质体法与内对照质粒pG L3-TK共转染HEK293细胞同时以不含启动子的pG L3-Basic载体与内对照质粒pG L3-TK共转染作为阴性对照组,化学发光仪检测相对荧光强度。结果与结论:(1)通过酶切和测序验证重组荧光素酶报告基因载体的DRD1基因启动子区序列正确;(2)与阴性对照组相比,该重组载体转染HEK293细胞后具有转录活性;(3)成功构建了含有DRD1基因启动子区的荧光素酶报告基因载体,为研究该基因的转录调控提供了基础工具。

per1,per2 3′UTR双荧光素酶报告基因重组质粒的构建

构建了包含目的片段小鼠节律基因per1,per2 3′UTR全长的重组质粒,为初步分析转录后可能调控per1,per2基因的miRNAs提供了有效手段。用反转录试剂盒将从小鼠肝脏组织提取的RNA反转录得到cDNA,以获得的cDNA为模板PCR扩增per1,per2 3′UTR全长,经回收纯化、酶切后将目的片段定向克隆到PGL3-promoter质粒上,再经转化扩增挑取克隆进行菌落PCR,对获得的阳性克隆进行酶切鉴定并测序。PCR产物鉴定结果表明,目的片段per1,per2 3′UTR序列扩增成功;菌落PCR及单酶切鉴定结果表明,per1,per2 3′UTR已插入PGL3-promoter载体中;测序结果表明,per1,per2 3′UTR插入序列,插入方向正确。per1,per2 3′UTR双荧光素酶报告基因重组质粒的成功构建为进一步研究节律基因转录后的调控机制奠定了基础。

PAI-1启动子序列与荧光素酶报告基因扩增及载体连接问题分析

目的探讨纤溶酶原激活物抑制剂-1(Plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)启动子荧光素酶表达质粒构建中扩增、转化、酶切及连接的问题。方法利用PCR技术扩增1100 bp长度PAI-1启动子片段,与PUC-19T载体连接,将PUC19T-PAI-1 1100质粒,及荧光素酶报告基因pGL3-Basic质粒转染大肠肝菌(DH5a)后扩增,提取并纯化;以BglⅡ,MluⅠ酶切,电泳并回收PAI-1 1100片段和pGL3-Basic酶切大片段,将PAI-1 1100片段插入荧光素酶报告基因pGL3-Basic中,构建含PAI-1 1100片段荧光素酶质粒。结果扩增PAI-11100 bp片段成功,目的片段与载体PUC19T,pGL3-Basic载体连接条件较苛刻,需要增加连接时间及效率的摸索。结论控制扩增时DNA浓度,胶回收,感受态质量,LB平板质量,内切酶,连接时间及质量比等问题都可增加连接成功概率。

双荧光素酶报告基因验证微小RNA410对白细胞介素-13基因的靶向调控作用

目的:验证微小RNA410(miR-410)对白细胞介素-13(IL-13) mRNA的靶向调控作用。方法:采用生物信息学软件预测miR-410与IL-13 mRNA 3’端非翻译区存在结合位点,设计并合成包含miR-410结合序列及突变序列的IL-13基因序列片段,分别构建野生型和突变型双荧光素酶基因载体,与miR-410和阴性对照序列共同转染293T细胞,检测转染后荧光素酶的活性,验证miR-410对IL-13 mRNA表达的影响。结果:生物信息学显示,IL-13 mRNA存在与miR-410的结合位点。基因测序结果显示,野生型和突变型荧光素酶报告基因载体构建成功。通过双荧光素酶报告系统发现,miR-410能够结合野生型IL-13 mRNA荧光素酶基因序列从而抑制其表达,而对突变型IL-13 mRNA的荧光素酶表达无影响(P<0.05)。结论:miR-410可以靶向调控IL-13mRNA的表达。

双荧光素酶报告基因系统验证Nlu-miRNA-8对Ccdc124的靶向调控

构建psi-CHECK2双荧光素酶报告基因载体,验证褐飞虱Nlu-miRNA-8对Ccdc124基因(coiledcoil domain-containing protein 124-like)表达的影响。首先设计合成包含与Nlu-miRNA-8结合序列的Ccdc124基因片段,构建双荧光素酶报告基因载体,转染果蝇S2细胞,通过荧光素酶活性变化观察NlumiRNA-8对Ccdc124表达的影响。结果发现,nlu-miRNA-8对Ccdc124组的荧光表达有非常显著的抑制作用,而对空白对照、阴性对照组的荧光表达没有显著的抑制作用。研究成功构建了psi-CHECK2/Ccdc1243′UTR载体,并初步证实Nlu-miRNA-8对Ccdc124基因有调控作用。

基于荧光素酶双报告基因系统体外验证长爪沙鼠Cip4基因受RXR及T4调控

目的 探讨核转录因子TRB、RXR和激动剂T4对长爪沙鼠Cip4基因表达的调控作用。方法 合成长爪沙鼠Cip4基因启动子区序列,构建报告载体p GL3-Cip4;将转录因子TRB、RXR克隆到pc DNA3. 1表达载体上。将p GL3-Cip4,pc DNA3. 1-TRB,pc DNA3. 1-RXR和pRL-TK(参照质粒)载体共转染到HEK-293细胞,构建Cip4基因的荧光素酶双报告系统。观察质粒用量、TRB的激动剂甲状腺素T4等处理对转录活性的影响。结果 以长爪沙鼠Cip4启动子区为启动序列的双荧光素酶报告基因系统在(启动子+转录因子):pRL-TK=20∶1、总质粒量为2μg时转染效率最高,并具有最高的荧光素酶活性。检测结果显示,仅加入TRB不改变Cip4的转录水平(P>0. 05),仅加入RXR可以增加Cip4的转录水平(P<0. 05),RXR与T4共同作用可上调Cip4的转录水平(P<0. 001)。TRB与T4共同作用可下调Cip4活性(P<0. 05)。RXR、TRB、T4共存时,Cip4的转录水平显著下调(P<0. 01)。结论本研究证实了T4、TRB及RXR共调控长爪沙鼠Cip4基因的转录,模拟了配体激活型转录因子TRB/RXR活化目的基因Cip4的转录,同时证实了Cip4的转录活化与RXR信号通路密切相关,为揭示甲状腺素在人类NAFLD中的作用机制奠定了基础。本报告基因系统可用于配体激活型转录因子调控Cip4基因表达的机理分析及相关药物的筛选。

牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因载体构建与活性检测

【目的】构建牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并检测其在C2C12细胞系中的表达活性。【方法】从牛外周血中提取基因组DNA,通过PCR方法从牛基因组DNA中克隆获得牛ATP5B基因的5′端转录调控区的1 898bp目的片段,通过设计引物逐段缺失后获得7个亚克隆,将其纯化后经SmaⅠ和KpnⅠ双酶切与pGL3-Basic载体连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,得到牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,经脂质体基因转染法转染C2C12细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶活性;运用在线软件Gen-omatix和TFSEARCH对ATP5B启动子区序列进行分析。【结果】成功克隆获得7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pATP5B-992、pATP5B-678、pATP5B-462和pATP5B-145;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,可知构建的重组质粒均有启动子活性,且重组质粒pATP5B-678和pATP5B-462与空载体pGL3-Basic的荧光素酶活性差异极显著。软件分析结果显示,ATP5B基因启动子区域-763^-85bp存在多个重要转录调控元件。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且证实-763^-230bp为牛ATP5B基因的核心启动子区域。

鸭IFN-β启动子双荧光素酶报告基因系统的构建及活性检测

通过PCR方法扩增获得6个不同长度的鸭IFN-β启动子DNA片段,并连接至萤火虫荧光素酶报告质粒p GL3.0,构建包含6个鸭IFN-β启动子的报告质粒。分别将构建的报告质粒与内参报告质粒p RL-TK转染至DEF细胞,检测报告质粒在不同刺激下的荧光素酶活性。结果表明:包含鸭IFN-β启动子全长的报告质粒p GL-IFN-β-1593能够有效地被相应刺激物激活;截短研究表明,包含390 bp鸭IFN-β启动子的报告质粒p GL-IFN-β-453的荧光素酶活性与全长基本一致,且一定程度上可降低冗余碱基的不良影响,因此选取该质粒用于鸭IFN-β启动子活性检测。本研究建立的基于荧光素酶双报告基因系统的鸭IFN-β启动子活性检测方法,为后续鸭IFN-β通路研究提供了检测工具。

双荧光素酶报告基因技术验证miR-31对LATS2的靶向调控作用

目的通过双荧光素酶报告基因技术验证miR-31对大肿瘤抑制因子2(LATS2)的靶向调控作用,观察miR-31在心肌细胞肥大过程中的可能影响。方法运用Targetscan软件预测大鼠miR-31对LATS2的靶向调控作用;以双荧光素酶报告质粒为工具载体,分别插入人工合成的大鼠LATS2基因野生型3′UTR(LATS2-3′UTR-WT)及突变型3′UTR(LATS2-3′UTR-MU)片段,构建LATS2-3′UTR-WT及LATS2-3′UTR-MU双荧光素酶报告质粒;重组双荧光素酶报告质粒分别与miR-31过表达质粒共转染293T细胞,检测荧光素酶活性并分析miR-31对LATS2的靶向调控作用;血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导体外心肌细胞肥大模型,RT-qPCR检测miR-31、LATS2及心肌细胞肥大基因心房钠尿肽(ANP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)的表达,F肌动蛋白荧光探针观察心肌细胞形态变化。结果Targetscan软件预测结果显示,大鼠miR-31与LATS2基因3′UTR存在互补结合位点;经酶切及基因测序鉴定,成功构建LATS2-3′UTR-WT及LATS2-3′UTR-MU双荧光素酶报告质粒;与LATS2-3′UTR-MU+miR-31组相比,LATS2-3′UTR-NC+miRNA-31组荧光素酶活性无明显变化(0.98±0.03vs.1.00±0.03,P>0.05),而LATS2-3′UTR-MT+miR-31组与LATS2-3′UTR-NC+miR-31组相比,荧光素酶活性显著降低(0.74±0.02vs.1.00±0.03,P<0.01);AngⅡ诱导48h后可检测到心肌细胞肥大基因ANP(P<0.01)及β-MHC表达上调(P<0.05),心肌细胞肥大过程中miR-31表达显著上调(P<0.01),LATS2基因明显下调(P<0.05),96h后心肌细胞表面积明显增大。结论miR-31可通过与LATS2基因3′UTR互补结合实现其对LATS2靶向调控作用,miR-31靶向作用LATS2可能参与调控心肌细胞的肥大。

利用Gal4/VP16-UAS和双荧光素酶报告基因系统检测γ-分泌酶活性

目的:确立基于Gal4/vp16-UAS和双荧光素酶报告基因系统检测γ-分泌酶切割淀粉样前体蛋白活性的方法。方法:将插入上游激活序列(UAS)和萤火虫荧光素酶报告基因的质粒MH100,嵌合酵母活性转录因子(Gal4)、单纯疱疹病毒蛋白(VP16)和γ-分泌酶切割位点的质粒C99-GVP,以及海肾荧光素酶质粒pRL-CMV,用脂质体转染法转入稳定表达淀粉样前体蛋白C末端的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),用免疫沉淀Westernblot分析法检测β-淀粉样蛋白(Aβ)的生成,利用Gal4/vp16-UAS和双荧光素酶报告基因系统测定荧光素酶报告基因的表达。结果:免疫沉淀Westernblot分析表明A(的生成在γ-分泌酶激活剂神经节苷脂GM1作用下升高并呈剂量依赖性,同时双荧光素酶法检测γ-分泌酶活性也同步升高。在γ-分泌酶抑制剂作用下Aβ的产生呈剂量依赖性的减少,同时γ-分泌酶活性也同步降低。结论:基于Gal4/vp16-UAS和双荧光素酶报告基因系统检测γ-分泌酶活性的方法有效可靠,是一种敏感、定量的检测方法。