双荧光素酶报告基因检测斑马鱼c-Myb与lect2l的靶标关系

目的:构建斑马鱼lect2l基因启动子双荧光报告基因系统,研究lect2l是否是受c-Myb蛋白特异性调控的靶基因。方法:采用PCR方法克隆斑马鱼lect2l基因启动子序列,构建重组荧光素酶报告基因载体pGL4.20-lect2lp,并采用阳离子脂质体法将其与c-myb表达载体及pRL-CMV内参质粒共转染293T细胞,使用化学发光仪检测荧光强度并计算比值。结果:电泳显示酶切条带符合斑马鱼lect2l基因启动子序列长度,构建的重组荧光素酶报告基因质粒pGL4.20-lect2lp荧光素酶活性的表达是对照组的30.34倍。结论:斑马鱼lect2l基因启动子驱动的荧光素酶表达载体pGL4.20-lect2lp构建成功,双荧光素酶报告基因系统提示斑马鱼c-Myb蛋白对lect2l基因有转录激活作用。

CXCR4-3’-UTR双荧光素酶报告基因载体的构建及与microRNA-494的靶向作用

目的 构建野生型与突变型CXCR4基因3’-非编码区(3’-UTR)的双荧光素酶报告基因载体,验证microRNA-494 (miR-494)对CXCR4的靶向调控作用。方法 使用生物信息学相关软件预测miR-494与CXCR4之间的靶向关系;利用PCR法扩增CXCR4的目的基因片段构建野生型与突变型CXCR4基因3’-UTR的双荧光素酶报告基因载体;将miR-494模拟物和阴性对照物分别与野生型pMIR-CXCR4-wt-3’-UTR或突变型pMIR-CXCR4-mut-3’-UTR双荧光素酶报告基因载体共同转染NRK-49F细胞,然后进一步检测相对荧光值。结果 成功构建野生型与突变型CXCR4基因3’-UTR的双荧光素酶报告基因载体,荧光结果显示加入miR-494模拟物可使野生型pMIR-CXCR4-wt-3’-UTR的荧光素酶活性降低约52%,但突变型pMIR-CXCR4-mut-3’-UTR的荧光素酶活性与对照组相比无显著变化。结论 初步证实miR-494与CXCR4之间存在靶向调控关系。

一种检测蛋白酶活性的荧光素酶报告基因系统的构建及应用

为建立一种检测蛋白酶活性的方法,本研究将IL-1β前体基因和荧光素酶基因融合,克隆至p CAGGS真核载体,构建了基于荧光素酶的报告基因系统(iGLuc),同时构建GLuc真核表达质粒作为对照。以PRRSV nsp4和ASFV S273R蛋白酶为检测对象,利用该报告基因系统对病毒蛋白酶活性进行检测,将iGLuc中蛋白酶酶切位点(FVCDAN)相对应的基因序列替换为Kpn I酶切位点,构建重组质粒Kpn I-iGLuc,然后分别将PRRSV nsp4和ASFV S273R蛋白酶切割位点对应的核酸序列插入至报告基因Kpn I-iGLuc中的Kpn I位点,构建重组质粒nsp4-iGLuc和S273R-i GLuc。分别将报告基因质粒(iGLuc、GLuc、Kpn I-i GLuc、nsp4-i GLuc和S273R-iGLuc)与不同剂量的相应蛋白酶真核表达质粒共转染HEK293T细胞,24 h后检测上清中荧光素酶GLuc的活性。结果显示,转染i GLuc、nsp4-iGLuc或S273R-iGLuc质粒的上清中荧光信号随着相应蛋白酶的剂量增加而升高,呈现剂量依赖性,而缺失蛋白酶切位点的对照质粒无该现象,表明构建的荧光素酶报告基因能够特异性地检测细胞蛋白酶和病毒蛋白酶的活性。本研究首次建立了一种检测蛋白酶活性的方法,并以PRRSV nsp4和ASFV S273R蛋白酶验证了该方法的应用价值,为后续开展高通量化筛选抗PRRSV、ASFV等药物的研究奠定了基础。

基于Golden Gate高效构建psiCHECK双荧光素酶报告基因的方法及应用

目的 基于Golden Gate技术构建psiCHECK-CcdB重组双荧光素酶报告载体,并探讨其能否用于RNA干扰(RNA interference, RNAi)药物筛选。方法 通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增CcdB致死基因、氯霉素基因与Golden Gate组装所需的BsmBI酶切位点,将其克隆至psiCHECK-2载体,构建出重组载体psiCHECK-CcdB。利用2种大肠杆菌DB3.1与DH5α对该载体的致死效率进行检测,选用1 387 bp大小的外源片段克隆至psiCHECK-CcdB载体,检测其连接效率,并验证重组载体能否发挥双荧光素酶报告系统功能,监测目的基因的表达变化。结果 菌落PCR以及测序鉴定psiCHECK-CcdB重组质粒构建成功,该质粒可有效致死无法耐受CcdB毒素的大肠杆菌DH5α菌株,在DB3.1菌株中正常生长。采用Golden Gate的方法可将外源片段简单快速克隆至psiCHECKCcdB载体中,连接效率显著提高且低背景克隆。通过测定双荧光素酶表达强度,证实了小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)靶向性结合目的基因可显著下调荧光素酶的表达,成功发挥双荧光素酶报告基因功能。结论 本研究成功构建了psiCHECK-CcdB重组双荧光素酶报告载体,应用Golden Gate组装技术,简化了实验操作流程,降低了实验成本,具备较高的阳性克隆率与多片段一次性组装的潜力,在RNAi药物筛选领域应用前景广阔。

牦牛KSR2基因的双荧光素酶质粒构建及其与bta-miR-22-3p的靶向验证

为了鉴定牦牛体内bta-miR-22-3p与KSR2之间的靶向关系,本研究采用miRNA Base数据库对牦牛体内bta-miR-22-3p的序列进行分析,并用Target scan软件预测牦牛bta-miR-22-3p于KSR2基因的3’UT R可能存在的结合位点,然后采用PCR扩增出包含bta-miR-22-3p结合位点的牦牛KSR2基因3'非编码区(3’UTR)片段,并构建出KSR2基因的3’UTR的野生型双荧光素酶报告基因质粒和突变型双荧光素酶报告基因质粒,并将其与bta-miR-22-3p mimics、mimics NC共转染至人胚肾细胞(HEK 293T细胞)中,检测其双荧光素酶活性。miRNA Base数据库中bta-miR-22-3p的序列为AAGCUGCCAGUUGAAGAACU G;Target scan预测出bta-miR-22-3p共有包括KSR2基因在内的568个潜在靶基因,其中包括612个保守位点和190个低保守位点,并且在KSR2基因3’UTR的829-836 bp处存在潜在的bta-miR-22-3p的结合位点;构建的野生型质粒和突变型质粒经双酶切后释放出大小315 bp的条带,测序结果与预期一致,说明质粒构建成功;bta-miR-22-3p mimics能够显著降低(P<0.01)KSR2野生型质粒双荧光素酶的活性。最终说明,牦牛KSR2基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体构建成功,并且该基因与bta-miR-22-3p存在靶向关系。

B7-H1启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性检测

目的构建含B7-H1启动子的荧光素酶报告基因载体,转染肝癌Hep G2细胞进行活性检测。方法 PCR扩增B7-H1启动子上游区域基因片段,并插入到含有荧光素酶报告基因的载体PGL3-Basic中构建重组子,经双酶切和测序鉴定后,将重组子转染Hep G2细胞,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶表达活性。结果成功地构建了6种不同长度的PGL3-B7-H1-Luc荧光素酶表达质粒,分别命名为P88、P175、P203、P398、P723和P960。瞬时转染Hep G2后经报告基因检测,P175、P203、P398、P723和P960所含5段启动子均具有转录活性,IFN-γ作用后启动子活性明显增强,而P88转染组IFN-γ作用后,荧光素酶活性无显著变化。结论成功构建了B7-H1启动子的荧光素酶报告基因载体。

双荧光素酶报告基因系统检测CYP3A4* 1G增强CYP3A4表达的调控作用

目的:探讨CYP3A4*1G增强CYP3A4基因表达的负调控作用。方法:设计合成包含CYP3A4*1G G或A等位基因的一系列基因片段(外显子10与内含子10交界处287和181 bp),构建CYP3A4*1G正向位于CYP3A4启动子上游的荧光素酶报告基因载体,与内参质粒pRL-TK共转染Hep G2细胞,通过双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。结果:与CYP3A4启动子相比较,G与A等位基因在287 bp DNA片段中均降低了荧光素酶表达(F=795.575,P<0.001),且G与A等位基因对CYP3A4启动子活性的抑制程度比较差异无统计学意义(P>0.05)。与CYP3A4启动子相比较,G与A等位基因在181 bp DNA片段中均降低了荧光素酶表达(F=23.218,P<0.001),而G与A等位基因对CYP3A4启动子活性的抑制程度比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:在CYP3A4内含子10与外显子10交界处CYP3A4*1G存在与CYP3A4*1G变异无关的CYP3A4启动子的抑制元件,该抑制元件对CYP3A4*1G增强CYP3A4基因表达起负调控作用。

基于双荧光素酶报告基因的DNA损伤与修复检测系统的建立与应用

目的:建立一种能够同时对环境致癌物所致HepG2细胞DNA损伤和细胞对损伤DNA的修复能力进行快速检测的系统。方法:5μmol/L氯化镉体外损伤质粒pTK-RL,质粒pgadd153-luc和体外受损的质粒pTK-RL共转染到HepG2细胞中,以16种已知致癌物或3种无遗传毒性的非致癌物刺激细胞,利用双荧光素酶检测方法同时检测DNA损伤和细胞的修复能力;双荧光素酶检测系统检测居民区、垃圾焚烧厂和农田3个不同污染区土壤中非挥发性有机提取物对DNA的损伤作用和细胞对该损伤的修复能力;彗星实验检测DNA的损伤。结果:双荧光素酶报告基因检测系统均可检出已知环境致癌物对DNA损伤与修复能力的影响,非致癌物均未检测到DNA损伤作用和对细胞DNA修复能力的影响;3个不同污染区土壤中非挥发性有机提取物均可诱导DNA损伤并抑制细胞对DNA损伤的修复能力,强度为居民区>垃圾焚烧厂>农田土壤。结论:在本研究条件下建立了可同时检测环境致癌物DNA损伤与细胞修复能力的双荧光素酶报告基因检测系统并可用于环境污染区检测。

牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因载体构建与活性检测

【目的】构建牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并检测其在C2C12细胞系中的表达活性。【方法】从牛外周血中提取基因组DNA,通过PCR方法从牛基因组DNA中克隆获得牛ATP5B基因的5′端转录调控区的1 898bp目的片段,通过设计引物逐段缺失后获得7个亚克隆,将其纯化后经SmaⅠ和KpnⅠ双酶切与pGL3-Basic载体连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,得到牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,经脂质体基因转染法转染C2C12细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶活性;运用在线软件Gen-omatix和TFSEARCH对ATP5B启动子区序列进行分析。【结果】成功克隆获得7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pATP5B-992、pATP5B-678、pATP5B-462和pATP5B-145;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,可知构建的重组质粒均有启动子活性,且重组质粒pATP5B-678和pATP5B-462与空载体pGL3-Basic的荧光素酶活性差异极显著。软件分析结果显示,ATP5B基因启动子区域-763^-85bp存在多个重要转录调控元件。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且证实-763^-230bp为牛ATP5B基因的核心启动子区域。

鸭IFN-β启动子双荧光素酶报告基因系统的构建及活性检测

通过PCR方法扩增获得6个不同长度的鸭IFN-β启动子DNA片段,并连接至萤火虫荧光素酶报告质粒p GL3.0,构建包含6个鸭IFN-β启动子的报告质粒。分别将构建的报告质粒与内参报告质粒p RL-TK转染至DEF细胞,检测报告质粒在不同刺激下的荧光素酶活性。结果表明:包含鸭IFN-β启动子全长的报告质粒p GL-IFN-β-1593能够有效地被相应刺激物激活;截短研究表明,包含390 bp鸭IFN-β启动子的报告质粒p GL-IFN-β-453的荧光素酶活性与全长基本一致,且一定程度上可降低冗余碱基的不良影响,因此选取该质粒用于鸭IFN-β启动子活性检测。本研究建立的基于荧光素酶双报告基因系统的鸭IFN-β启动子活性检测方法,为后续鸭IFN-β通路研究提供了检测工具。

利用Gal4/VP16-UAS和双荧光素酶报告基因系统检测γ-分泌酶活性

目的:确立基于Gal4/vp16-UAS和双荧光素酶报告基因系统检测γ-分泌酶切割淀粉样前体蛋白活性的方法。方法:将插入上游激活序列(UAS)和萤火虫荧光素酶报告基因的质粒MH100,嵌合酵母活性转录因子(Gal4)、单纯疱疹病毒蛋白(VP16)和γ-分泌酶切割位点的质粒C99-GVP,以及海肾荧光素酶质粒pRL-CMV,用脂质体转染法转入稳定表达淀粉样前体蛋白C末端的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),用免疫沉淀Westernblot分析法检测β-淀粉样蛋白(Aβ)的生成,利用Gal4/vp16-UAS和双荧光素酶报告基因系统测定荧光素酶报告基因的表达。结果:免疫沉淀Westernblot分析表明A(的生成在γ-分泌酶激活剂神经节苷脂GM1作用下升高并呈剂量依赖性,同时双荧光素酶法检测γ-分泌酶活性也同步升高。在γ-分泌酶抑制剂作用下Aβ的产生呈剂量依赖性的减少,同时γ-分泌酶活性也同步降低。结论:基于Gal4/vp16-UAS和双荧光素酶报告基因系统检测γ-分泌酶活性的方法有效可靠,是一种敏感、定量的检测方法。

小鼠CCL1基因双荧光素酶报告质粒构建及其与miR-21a-5p靶向关系验证

为了验证miR-21a-5p与CCL1基因的靶向关系,试验利用生物信息学软件预测miR-21a-5p和CCL1基因的结合位点,设计引物合成CCL1基因3′非翻译区(UTR)野生型及突变型目的片段,并将其克隆到psiCHECK2质粒上构建CCL1野生型(CCL1-WT)和突变型(CCL1-MUT)双荧光素酶报告质粒。将构建好的CCL1-WT和CCL1-MUT分别与miR-21a-5p模拟物(miR-21a-5p mimic)和阴性对照(miR-NC)共同转染到293T细胞中,检测CCL1-WT+miR-NC组、CCL1-WT+miR-21a-5p mimic组、CCL1-MUT+miR-NC组、CCL1-MUT+miR-21a-5p mimic组的荧光素酶活性。结果表明:CCL1基因是miR-21a-5p的潜在靶基因;CCL1野生型和突变型双荧光素酶报告质粒测序结果与预期结果一致;与CCL1-WT+miR-NC组相比,CCL1-WT+miR-21a-5p mimic组荧光素酶活性显著降低(P<0.05),而CCL1-MUT+miR-NC组与CCL1-MUT+miR-21a-5p mimic组之间差异不显著(P>0.05)。说明CCL1基因野生型及突变型双荧光素酶报告质粒构建成功,且miR-21a-5p与CCL1基因存在靶向关系。

基于纳米抗体-荧光素酶的黄曲霉毒素B1检测方法构建

黄曲霉毒素B1(AFB1)是一种剧毒、致癌的食源性污染物,严重威胁食品安全和公共健康。为开发快速检测AFB1的生物发光酶联免疫分析(BLEIA)方法,系统测试了3种抗AFB1特异性纳米抗体(NB)与纳米荧光素酶(Nluc)融合蛋白(G8-Nluc、Nluc-NB26和Nluc-NB28)的可溶性表达、纯化情况及酶催化活性。基于3种融合蛋白分别建立BLEIA检测体系,选择Nluc-NB26用于谷物样品的分析和验证。结果表明,Nluc-NB26的可溶性表达量最高,稳定性更好,Nluc-NB28的可溶性表达量次之,而G8-Nluc基本不可溶。不同表面活性剂对G8-Nluc的促溶解性研究表明,添加N-月桂酰肌氨酸钠可显著提高其溶解度,纯化得到的3种融合蛋白均具有良好的酶活性及抗原结合活性。基于融合蛋白的BLEIA检测结果显示,Nluc-NB28-BLEIA、G8-Nluc-BLEIA和Nluc-NB26-BLEIA体系检测AFB1的IC_(50)值分别为4.213,1.697,2.169 ng/mL,表明G8-Nluc-BLEIA体系的灵敏度最高,Nluc-NB26-BLEIA与前者接近,Nluc-NB28-BLEIA最低。综合考虑融合蛋白的可溶性表达量、稳定性及检测性能,对Nluc-NB26-BLEIA开展实际样品的分析和验证,结果表明:这一方法检测谷物中AFB1的平均回收率在91.1%~104.1%之间,与商业化酶联免疫吸附测定试剂盒结果相似,而检测的时间和试剂成本明显降低。研究结果为开发快速、高灵敏的AFB1检测技术提供参考。

虫荧光素酶报告基因用于二噁英类化学物质的检测

虫萤光素酶报告基因检测二英类化学物质与传统的EROD法比较 ,灵敏度及线性范围均优于EROD法 ,并且检测时间缩短 ,操作简便。

TNF-α3′-UTR双荧光素酶报告基因系统的构建及丹参酮类药物筛选

目的构建并鉴定p GL3-TNF-α3'端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因(DLR)表达系统,以此基于调控TNF-α转录后水平对丹参酮类成分进行筛选。方法反转录人脐静脉内皮细胞HUVEC的mRNA成c DNA,以之为模板,PCR扩增含TNF-α3'-UTR的DNA片段全长,经酶切后连接至荧光素酶报告载体p GL3-control上,构建出p GL3-TNF-α3'UTR全长的荧光素酶报告基因载体并进行鉴定。将所构建的p GL3-TNF-α3'UTR与p SVRenilla质粒组成双荧光素酶报告系统共转染至单核巨噬细胞RAW264.7,经脂多糖诱导后利用该双荧光素酶报告基因表达系统判定丹参酮类成分对TNF-α转录后调控是否有影响。结果成功构建p GL3-TNF-α3'UTR荧光素酶报告基因,克隆获得的DNA片段大小及序列与Genbank报道的一致。脂多糖(LPS)可以明显诱导转入p GL3-TNF-α3'UTR载体细胞的荧光强度。丹参酮类成分中隐丹参酮可以明显降低LPS诱导的p GL3-TNF-α3'UTR载体细胞的荧光素酶活性。结论成功构建含TNF-α3'UTR区的双荧光素酶报告基因表达系统,并以此从丹参酮类化合物中筛选出隐丹参酮,可以对TNF-α的转录后水平进行抑制调控。

一种新型双荧光素酶报告基因表达载体的构建

目的:构建一种新型的双荧光素酶报告基因表达载体。方法:设计并扩增海肾荧光素酶基因hRLUC,将其插入到双酶切的含有萤火虫荧光素酶报告基因(Firefly)的载体pGL4.10中,得到pGL4.10-hRLUC;使用lipofectamine3000将pGL4.10和pGL4.10-hRLUC分别转染入HEK293细胞,检测细胞中荧光素酶活性,以未转染细胞作对照。结果:使用PCR方法获得hRLUC表达单元(2 350 bp);双荧光素酶报告基因表达载体pGL4.10-hRLUC经酶切和测序鉴定,插入正确。转染pGL4.10组荧光素酶活性相对值为(220.311±2.082);转染pGL4.10-hRLUC的细胞中荧光素酶活性低于pGL4.10转染细胞,高于未转染细胞(P<0.05)。结论:成功构建了双荧光素酶报告基因(hRLUC和Firefly)表达载体。

双荧光素酶报告基因系统的应用研究进展

双报告基因即在一个信号系统内同时表达,但独立测量的两个荧光酶的报告基因。在双报告基因系统中,一个报告基因活性的改变,与基因表达的特定实验条件相关,而另个报告基因的组成型活性则提供内对照,使实验值正态化。目前很多实验都采用了荧光素酶报告基因(Luc),但从检测速度、灵敏度和线性范围来考虑,双荧光素酶即萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)和海肾荧光素酶(Renilla luciferase)的组合,可以较好地体现检测结果的精确性。本文以萤火虫双荧光素酶报告基因系统为重点,综述了该报告系统的特点、应用和近年来的研究进展。

Id1启动子的荧光素酶报告基因载体的构建及其在肝癌HepG2细胞中的活性检测

目的:扩增Id1启动子基因,构建Id1启动子的报告基因载体.方法:通过PCR及双酶切方法,从HepG2细胞基因组DNA中获得Id1基因编码序列上游包含不同长度碱基的两段Id1启动子序列;分别克隆到报告基因pGL3-enhancer载体上,构建包含两段不同长度Id1启动子的报告基因载体;用脂质体转染法将两报告基因载体分别转染至肝癌HepG2细胞系;采用双荧光素酶报告基因系统评估Id1启动子活性.结果:经PCR方法扩增出大小分别为1096bp和266bp的两段不同长度的Id1启动子片段,序列测定其编码序列及读框正确,酶切鉴定亚克隆序列正确.瞬时转染HepG2后经报告基因检测,两段启动子均具有转录活性.结论:成功构建了Id1启动子的报告基因载体,为进一步研究Id1启动子和肝癌的关系奠定了实验基础.

STAT3荧光素酶报告基因检测系统的构建及其检测STAT3活化能力的研究

目的构建STAT3荧光素酶报告基因检测系统并检测STAT3活化能力,为筛选STAT3活性调控相关药物提供实验基础。方法基因合成STAT3反应元件序列,退火形成含酶切位点的双链DNA,内切酶XhoⅠ和HindⅢ双酶切报告基因载体p GL6-TA,T4 DNA连接酶将STAT3反应元件插入p GL6-TA载体多克隆位点,将该载体转染He La细胞,G418筛选STAT3荧光素酶报告基因稳定表达的单克隆He La细胞株。5,10,20 ng/ml不同浓度激动剂IL-6和20,40,80μmol/L抑制剂S3I-201刺激单克隆He La-STAT3-Luc细胞,检测荧光素酶对应的发光值验证STAT3荧光素酶报告基因检测系统的检测能力。结果测序和比对结果显示,STAT3荧光素酶报告基因系统p GL6-STAT3-Luc中STAT3反应元件序列正确;G418成功筛选出稳定表达STAT3荧光素酶报告基因的单克隆He La细胞株;5,10和20 ng/ml浓度IL-6可刺激He La-STAT3-Luc细胞中荧光素酶的活性显著升高(P<0.001),且分别升高5.4,10.3和20.0倍;不同时间点检测1 ng/ml和5 ng/ml浓度IL-6刺激He La-STAT3-Luc细胞,其荧光素酶的活性呈现线性增长趋势;40μmol/L和80μmol/L浓度的抑制剂S3I-201与10 ng/ml浓度IL-6共刺激He La-STAT3-Luc细胞,其荧光素酶的活性显著降低(P<0.001),STAT3活化的抑制率分别为18.9%和43.7%。结论成功构建STAT3荧光素酶报告基因检测系统,该系统具有有效检测STAT3活化水平的能力。

双荧光素酶报告基因系统验证hsa-miR-1291对ARHGAP29基因的调控作用

目的验证hsa-miR-1291对ARHGAP29基因的靶向调控作用。方法利用PCR方法,根据目的基因ARHGAP29的3′非编码区(3′untranslated region,3′UTR)序列信息设计扩增引物,以293T细胞基因组DNA为模板,扩增ARHGAP29基因的野生型3′UTR片段(ARHGAP 29-WT 3′UTR)及突变型3′UTR片段(ARHGAP29-MUT 3′UTR),并将其分别克隆到双荧光素酶报告pmiR-RB-Report载体中,构建双荧光素酶基因报告载体,即野生型载体ARHGAP29-WT 3′UTR pmiR-RB-Report和突变型载体ARHGAP29-MUT 3′UTR pmiR-RB-Report。将hsa-miR-1291 mimic、阴性对照(non-target control,NC组)同野生型载体、突变型载体载体分别共转染于293T细胞中,进一步检测相对荧光值。结果成功构建ARHGAP29-WT 3′UTR pmiR-RB-Report载体(野生型载体)、ARHGAP29-MUT 3′UTR pmiR-RB-Report载体(突变型载体)。荧光检测结果显示,野生型载体转染hsa-miR-1291 mimic后,其荧光表达较NC组明显下降(0.67±0.04 vs 1.00±0.08,P=0.014);转染hsa-miR-1291 mimic后,突变型载体的荧光表达相对于野生型载体的荧光表达有所上升(1.20±0.05 vs 0.67±0.04,P<0.001)。结论初步证实hsa-miR-1291很可能对ARHGAP 293′UTR上的该位点有靶向调控作用。