利用双荧光素酶报告系统鉴定靶向作用猪CD163基因的miRNA

为了进一步筛选获得抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖的候选mi RNA,为猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)防治及猪的抗病育种提供新策略,通过3′RACE(Rapid-amplification of c DNA ends)测序获得了猪CD163基因3′UTR的完整序列,生物信息学分析发现其具有mi R-181c、mi R-181d、mi R-23b、mi R-4262等mi RNA的作用靶点。利用双荧光素酶报告系统检测发现,与阴性对照组相比,mi R-181c、mi R-181d、mi R-23b和mi R-4262均可极显著(P<0.01)抑制荧光素酶的相对活性,其中mi R-181d抑制效果最佳。

SLC2A9基因rs13137074位点双荧光素酶报告系统的构建及其对基因活性的影响

目的构建该实验室定点突变联合双荧光素酶报告系统,并通过该系统了解rs13137074基因位点突变对葡萄糖易化转运蛋白-9(SLC2A9)基因转录活性的影响。方法采用定点突变法对rs13137074基因位点进行点突变,并通过双酶切的方式连接构建双荧光素酶报告系统质粒。随后通过细胞转染及荧光素酶检测等方法确定突变位点对SLC2A9基因转录活性的影响程度。结果rs13137074基因位点突变成功;质粒转染过程中Lipofectamine 3000终水平为1.5μL/mL,转染时间为48 h时效果最佳;rs13137074位点发生突变时可导致SLC2A9基因转录活性下降23.60%。结论人群血尿酸水平可能受SLC2A9基因调控区rs13137074位点单核苷酸多态性的影响。

腺病毒介导的双荧光素酶报告系统的构建及其应用

目的:构建腺病毒介导的双荧光素酶报告系统,并利用其筛选一种广谱高活性启动子。方法:将待检测启动子控制的萤火虫荧光素酶(Fluc)基因表达框插入腺病毒E1区,CMV启动子控制的海肾荧光素酶(Rluc)基因表达框插入E3区作为内参,构建腺病毒介导的双荧光素酶报告系统。检测不同病毒感染量条件下测得的启动子活性数据差异、组内差异,难转染细胞内的转染情况,分析该系统的操作简便性、稳定可靠性。应用该系统检测常用启动子CAG、CASI及新启动子CCAU在一系列细胞内的活性,从中筛选出一种广谱高活性启动子。结果:成功构建了腺病毒介导的双荧光素酶报告系统;不同MOI值下测得的各启动子相对活性值无显著差异(P>0.05);在所实验的细胞内均能有效且准确地测定各启动子的活性,且复孔间方差小;CCAU在所实验的9株细胞中的表达活性显著(P<0.05)或极显著地(P<0.01)高于CASI以及CAG的表达活性。结论:构建获得的腺病毒介导双荧光素酶报告系统操作简便、稳定可靠、通用性强,可作为启动子活性筛选的一种新方法;利用该系统筛选获得了一种新的广谱高活性启动子CCAU。

双荧光素酶报告系统鉴定hsa-miR-4443对TIMP2基因的调控作用

目的通过构建组织基质金属蛋白酶抑制剂-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2,TIMP2)荧光素酶报告基因载体,观察hsa-miR-4443对TIMP2的靶向调控作用。方法生物信息学软件预测hsa-miR-4443与TIMP2 3′端非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)的结合位点,设计合成包含hsa-miR-4443结合序列及突变序列的TIMP2基因片段,构建野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体,分别与hsa-miR-4443模拟物和阴性对照序列共转染MDA-MB-231细胞,检测荧光素酶活性,观察hsa-miR-4443对TIMP2表达的影响。结果生物信息学分析显示在TIMP2 3′UTR有3个hsa-miR-4443的潜在结合位点,酶切和测序结果均提示3个结合位点的野生型和突变型荧光素酶报告载体构建成功。hsa-miR-4443可通过第1个结合位点抑制野生型TIMP2载体的荧光素酶的表达,而对突变型载体的荧光素酶表达无影响(P=0.002)。结论 hsa-miR-4443可以靶向调控TIMP2的表达。

双荧光素酶报告系统鉴定miRNA-3133对200kD黏着斑激酶家族相互作用蛋白基因的靶向调控作用

目的通过构建分子量大小为200 kD的黏着斑激酶家族相互作用蛋白(FIP200) 3’UTR双荧光素酶报告基因载体,研究FIP200与mi R-3133的靶向关系。方法采用生物信息学软件targetscan预测mi R-3133与FIP200 3’端非翻译区(3’UTR)潜在的互补结合位点;利用PCR扩增FIP200基因3’UTR序列,并克隆到psicheck2载体中,构建FIP200野生型和突变型重组双荧光素酶报告基因载体;将野生型psicheck2-FIP200-wt 3’UTR或突变型psicheck2-FIP200-mut 3’UTR双荧光素酶报告质粒分别与mi RNA-3133 mimics或mimics-NC共转染CNE-1细胞;通过双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性,观察mi RNA-3133对FIP200表达的影响。结果生物信息学分析显示FIP200 3’UTR与mi RNA-3133有潜在的结合位点,酶切和测序结果表明野生型和突变型双荧光素酶报告载体构建成功;双荧光素酶报告系统检测显示,mi RNA-3133可抑制野生型FIP200载体的荧光素酶的表达(P <0.05),而对突变型载体的荧光素酶表达无影响(P> 0.05)。结论成功构建FIP200基因3’UTR的双荧光素酶报告载体,mi RNA-3133可以直接靶向调控FIP200基因的表达。

双荧光素酶报告系统鉴定miR-204对水通道蛋白1基因的调控作用

[目的]构建水通道蛋白1(AQP1)基因3’-UTR双荧光素酶报告载体,并验证miR-204与AQP1基因的靶向调控关系。[方法]采用生物信息学软件预测miR-204与AQP1基因的结合位点;荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测转染miR-204抑制剂前后miR-204及AQP1在K562细胞中的表达改变;构建AQP1-3’UTR野生型及突变型重组质粒,与miR-204、阴性对照共转染至293T细胞中,双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。[结果]转染miR-204抑制剂后,miR-204表达量较阴性对照及空白对照组明显下降,分别为1. 97、9. 32、11. 25(P <0. 01);而AQP1基因表达显著增高,分别为13. 14、2. 29、2. 54(P <0. 01);酶切及测序结果表明已成功构建psi CHECKTM-2-AQP1 3’-UTR野生型和突变型重组质粒。荧光素酶活性结果表明,miR-204可使野生型AQP1 3’-UTR质粒荧光素酶活性降低约65. 9%,而对突变型质粒荧光素酶活性没有显著影响。[结论]成功构建了AQP1基因3’-UTR的荧光素酶报告基因载体,miR-204对AQP1存在靶向调控。

p53激活抗肿瘤药物应用p21途径双荧光素酶报告系统筛选初步研究

目的:构建含人p21启动子的双荧光素酶报告载体,感染肿瘤细胞后用于检测p53激活的抗肿瘤药物筛选。方法:从人血白细胞DNA中克隆p21启动子,用于控制Firefly荧光素酶的表达;Renilla荧光素酶基因和EGFP基因与IRES相连,在CMV启动子控制下表达;将上述元件和基因克隆至载体pLL3.7中,应用酶切和测序反应验证后再转染至U251和Eca109肿瘤细胞建立细胞检测模型。结果:成功构建含人p21启动子、大小约13kb的pLL3.7-Dluc重组质粒,经LipofecttamineTM转染后用于细胞药物筛选;采用MTT方法对8种不同药物对U251和Eca109细胞处理后进行IC50检测,其中姜黄素和丹参酮ⅡA在U251肿瘤细胞中的IC50分别为20和8μg/mL,Eca109细胞的IC50分别为12和25μg/mL;药物作用转染后U251细胞48h后作荧光素酶检测,计算F/R值并SPSS 13.0分析,姜黄素和丹参酮ⅡA的P值分别为0.003和0.024,药物作用后荧光检测结果显著;该实验在Eca109细胞模型中姜黄素和丹参酮ⅡA取得了一致性的结果,P值分别为0.001和0.015。人参皂苷Rb1与阴性对照组相比差异有统计学意义,P=0.022。结论:通过p21途径检测双荧光素酶基因的表达状况,提示姜黄素、丹参酮ⅡA和人参皂苷Rb1三种药物在U251和Eca109肿瘤细胞中具有使p53活性增加的功能。

双荧光素酶报告基因系统验证hsa-miR-1291对ARHGAP29基因的调控作用

目的验证hsa-miR-1291对ARHGAP29基因的靶向调控作用。方法利用PCR方法,根据目的基因ARHGAP29的3′非编码区(3′untranslated region,3′UTR)序列信息设计扩增引物,以293T细胞基因组DNA为模板,扩增ARHGAP29基因的野生型3′UTR片段(ARHGAP 29-WT 3′UTR)及突变型3′UTR片段(ARHGAP29-MUT 3′UTR),并将其分别克隆到双荧光素酶报告pmiR-RB-Report载体中,构建双荧光素酶基因报告载体,即野生型载体ARHGAP29-WT 3′UTR pmiR-RB-Report和突变型载体ARHGAP29-MUT 3′UTR pmiR-RB-Report。将hsa-miR-1291 mimic、阴性对照(non-target control,NC组)同野生型载体、突变型载体载体分别共转染于293T细胞中,进一步检测相对荧光值。结果成功构建ARHGAP29-WT 3′UTR pmiR-RB-Report载体(野生型载体)、ARHGAP29-MUT 3′UTR pmiR-RB-Report载体(突变型载体)。荧光检测结果显示,野生型载体转染hsa-miR-1291 mimic后,其荧光表达较NC组明显下降(0.67±0.04 vs 1.00±0.08,P=0.014);转染hsa-miR-1291 mimic后,突变型载体的荧光表达相对于野生型载体的荧光表达有所上升(1.20±0.05 vs 0.67±0.04,P<0.001)。结论初步证实hsa-miR-1291很可能对ARHGAP 293′UTR上的该位点有靶向调控作用。

利用双荧光素酶报告系统鉴定小鼠Vamp8基因启动子核心区域及转录调控元件

目的通过构建小鼠Vamp8基因启动子及转录调节区荧光素酶报告质粒,寻找小鼠Vamp8基因启动子的核心区域及转录调控元件。方法通过检索美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因数据库和真核生物启动子数据库(EPD),获取包含可能的启动子及转录调节区域的小鼠Vamp8基因序列(-1033^+2330 bp)。以小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)基因组DNA为模板,PCR扩增钓取该序列,构建小鼠Vamp8基因启动子荧光素酶报告质粒,通过荧光素酶活性检测,验证其启动子活性。随后,通过截短突变及生物信息学分析,寻找小鼠Vamp8基因启动子的核心区和主要转录调控区,以及可能的转录因子。结果成功克隆了小鼠Vamp8基因的转录调控区,构建了5个系列截短的小鼠Vamp8基因启动子荧光素酶报告质粒和3个小鼠Vamp8基因转录调节区荧光素酶报告质粒,测序均正确。通过荧光素酶活性检测、生物信息学分析及验证,发现小鼠Vamp8基因-198^+85 bp区域的启动子活性最高,推测其为小鼠Vamp8基因启动子核心区域;而-1033^-199 bp和-198^-37 bp区域分别存在Vamp8基因转录负调控和正调控元件。转录因子CEBPB可促进Vamp8基因转录,其主要结合位点位于-198^-1 bp,与生物信息学预测相符。结论成功构建了小鼠Vamp8基因启动子及转录调节区双荧光素酶报告系统,发现小鼠Vamp8基因-198^+85 bp区域为该基因启动子核心区域,-1033^-199 bp和-198^-37 bp区域参与其转录调控。转录因子CEBPB可能通过与小鼠Vamp8基因-198^-1 bp区域的DNA序列结合,促进其转录。上述研究为阐明Vamp8基因转录调控的分子机制奠定了基础。

p53基因3′UTR双荧光素酶报告质粒的构建及其与miRNA-2127靶向关系的验证

为了验证miRNA-2127与p53基因的靶向关系,利用生物信息学软件预测p53与miRNA-2127的结合位点,全基因合成法合成该结合位点的野生型与突变型模板,并将其克隆到pmiR-RB-REPORT^(TM)双荧光素酶报告载体中,构建野生型与突变型重组双荧光素酶报告质粒。将293T细胞分为4组,分别共转染野生型报告质粒+阴性对照(NC)、野生型报告质粒+miRNA-2127、突变型报告质粒+NC、突变型报告质粒+miRNA-2127。检测各组细胞中荧光素酶活性差异,结果显示:共转染了野生型报告质粒+miRNA-2127的293T细胞与共转染了野生型报告质粒+NC组相比,荧光素酶活性显著降低(P<0.05);且突变型报告质粒+miRNA-2127组的相对荧光素酶活性显著高于野生型报告质粒+miRNA-2127(P<0.05),说明miRNA-2127能够靶向调控p53基因,且结合位点位于3′UTR区369—375间。

基于荧光素酶双报告基因系统体外验证长爪沙鼠Cip4基因受RXR及T4调控

目的 探讨核转录因子TRB、RXR和激动剂T4对长爪沙鼠Cip4基因表达的调控作用。方法 合成长爪沙鼠Cip4基因启动子区序列,构建报告载体p GL3-Cip4;将转录因子TRB、RXR克隆到pc DNA3. 1表达载体上。将p GL3-Cip4,pc DNA3. 1-TRB,pc DNA3. 1-RXR和pRL-TK(参照质粒)载体共转染到HEK-293细胞,构建Cip4基因的荧光素酶双报告系统。观察质粒用量、TRB的激动剂甲状腺素T4等处理对转录活性的影响。结果 以长爪沙鼠Cip4启动子区为启动序列的双荧光素酶报告基因系统在(启动子+转录因子):pRL-TK=20∶1、总质粒量为2μg时转染效率最高,并具有最高的荧光素酶活性。检测结果显示,仅加入TRB不改变Cip4的转录水平(P>0. 05),仅加入RXR可以增加Cip4的转录水平(P<0. 05),RXR与T4共同作用可上调Cip4的转录水平(P<0. 001)。TRB与T4共同作用可下调Cip4活性(P<0. 05)。RXR、TRB、T4共存时,Cip4的转录水平显著下调(P<0. 01)。结论本研究证实了T4、TRB及RXR共调控长爪沙鼠Cip4基因的转录,模拟了配体激活型转录因子TRB/RXR活化目的基因Cip4的转录,同时证实了Cip4的转录活化与RXR信号通路密切相关,为揭示甲状腺素在人类NAFLD中的作用机制奠定了基础。本报告基因系统可用于配体激活型转录因子调控Cip4基因表达的机理分析及相关药物的筛选。

CLPTM1L与miR-494靶向关系的双荧光素酶报告实验验证

目的:确定miR-494与CLPTM1L的靶向关系。方法:采用生物信息学方法预测miR-494与CLPTM1L基因的结合位点。采用PCR技术扩增CLPTM1L基因3'UTR片段,并克隆至pmir GLO载体,构建野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒。将培养的293T细胞分为4组,分别共转染miR-494或阴性对照和pmir GLO-CLPTM1L-W 3'UTR或pmir GLOCLPTM1L-M 3'UTR,检测4组细胞中荧光素酶活性。结果:酶切和测序证实成功构建了野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒pmir GLO-CLPTM1L-W 3'UTR和pmir GLO-CLPTM1L-M 3'UTR;与共转染miR-494 mimics和突变型CLPTM1L3'UTR质粒的293T细胞中荧光素酶活性(1.056 4±0.163 4)、共转染阴性对照序列和突变质粒的293T细胞中荧光素酶活性(0.961 3±0.177 9)或野生型质粒的293T细胞中荧光素酶活性(0.983 4±0.001 2)相比,共转染miR-494 mimics和野生型CLPTM1L 3'UTR质粒的293T细胞中荧光素酶活性(0.651 6±0.136 4)明显降低(F=4.476,P=0.040),其他3组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:CLPTM1L与miR-494存在靶向关系。

双荧光素酶报告基因系统在家蚕基因启动子研究中的应用

双荧光素酶报告基因系统是以萤火虫荧光素酶作为主报告基因、海肾荧光素酶作为内参对照的检测系统。它在不同物种的基因启动子转录活性的研究中发挥着重要的作用。目前,在家蚕中已经应用双荧光素酶报告基因系统研究了家蚕生长发育期间基因表达的变化以及病毒侵入家蚕细胞基因表达调控的分子机制等。文章对双荧光酶报告基因系统的发展历史、工作原理及其在家蚕基因启动子转录活性调控研究中的应用和其中存在的问题进行了论述,以期为今后相关研究工作的开展提供参考。

miRNA-7靶向SP1的3′UTR双荧光素酶报告基因载体构建及评价

目的:构建胃癌细胞核转录因子SP1的3′非翻译区(3′UTR)双荧光素酶报告基因载体,验证microRNA-7(miR-7)调控SP1的分子机制。方法:应用相关生物信息学软件预测miR-7靶向作用于SP1基因的3′UTR区;PCR扩增人胃黏膜上皮细胞SP1的3′UTR,插入至psiCHECK2载体双荧光素酶基因下游,构建野生型(w-3′UTR)和突变型重组表达载体(m-3′UTR),鉴定正确后,分别与miR-7模拟物(mimics)/抑制物(inhibitor)/阴性对照物(NC)共转染胃癌细胞MKN45,检测荧光素酶活性及SP1表达情况。结果:成功构建SP1的3′UTR野生型(psiCHECK2-SP1-w-3′UTR)和突变型(psiCHECK2-SP1-m-3′UTR)表达载体,双荧光素酶报告基因检测显示w-3′UTR/miR-7-mimics组的相对荧光素酶活性表达受抑制,与miR-7 NC组比较降低75%,差异具有统计学意义(P<0.001),而m-3′UTR/miR-7-mimics组的活性表达没有受到影响(P>0.05)。RT-PCR和Western blot检测结果显示miR-7-mimics组SP1表达水平低于miR-7 NC组(P<0.001),而miR-7-inhibitor组SP1表达水平高于miR-7 NC组(P<0.001)。结论:成功构建SP1的3′UTR野生型双荧光素酶报告基因表达载体,miR-7能够显著降低其荧光素酶活性,提示miR-7能靶向负调控SP1的表达。

双荧光素酶报告基因检测斑马鱼c-Myb与lect2l的靶标关系

目的:构建斑马鱼lect2l基因启动子双荧光报告基因系统,研究lect2l是否是受c-Myb蛋白特异性调控的靶基因。方法:采用PCR方法克隆斑马鱼lect2l基因启动子序列,构建重组荧光素酶报告基因载体pGL4.20-lect2lp,并采用阳离子脂质体法将其与c-myb表达载体及pRL-CMV内参质粒共转染293T细胞,使用化学发光仪检测荧光强度并计算比值。结果:电泳显示酶切条带符合斑马鱼lect2l基因启动子序列长度,构建的重组荧光素酶报告基因质粒pGL4.20-lect2lp荧光素酶活性的表达是对照组的30.34倍。结论:斑马鱼lect2l基因启动子驱动的荧光素酶表达载体pGL4.20-lect2lp构建成功,双荧光素酶报告基因系统提示斑马鱼c-Myb蛋白对lect2l基因有转录激活作用。

HIPK3基因3'UTR双荧光素酶报告质粒的构建及其与靶向miR-146的验证

目的构建HIPK3基因3'非编码区(3'UTR)双荧光素酶报告质粒,分析miR-146对HIPK3的调控作用。方法通过miRDB数据库和DIANA TOOLS数据库预测miR-146与HIPK3基因的结合位点。将HIPK3基因的3'UTR序列以及其突变体插入至荧光素酶报告质粒psi CHECK-2,构建野生型(HIPK3-WT)及突变型HIPK3-MU)重组双荧光素酶报告质粒。将培养的293T细胞分为6组,1)HIPK3-WT+NC阴性对照;2)HIPK3-WT+miR-146a mimics;3)HIPK3-WT+miR-146b mimics;4)HIPK3-MU+NC阴性对照;5)HIPK3-MU+miR-146a mimics;6)HIPK3-MU+miR-146b mimics,48 h后检测6组细胞中荧光素酶活性。结果成功构建了HIPK3-WT及HIPK3-MU重组双荧光素酶报告质粒;HIPK3-WT和miR-146b mimics共转染293T细胞后,荧光素酶活性降低(P<0.05)。结论 miR-146a与HIPK3基因不存在靶向关系,miR-146b可以调控HIPK3基因3'UTR。

环氧合酶2 mRNA 3’UTR荧光素酶报告基因载体的构建

目的:通过构建环氧合酶2(COX2)mRNA 3’UTR的全长及其截短体荧光素酶报告基因载体,为研究COX2基因在炎症条件下的的转录后调控提供有效的工具。方法:通过从胃癌细胞SGC-7901提取RNA,反转录成cDNA后,以此为模板,PCR扩增COX2 3’非翻译区(3’-UTR)全长及截短的序列,并将该序列连接到荧光素酶报告基因载体pGL3-control,构建pGL3-COX2 3’UTR全长及pGL3-COX23’UTR不同截短体。测序后将上述载体分别与pRL-TK载体共转染293-T细胞,48 h后裂解细胞检测荧光素酶的活性。最后通过ELISA检测在IL-1β的刺激下COX2的下游产物PGE2的表达,并再次测定pGL3-COX2 3’UTR全长的荧光素酶活性。结果:成功构建了pGL3-COX2 3’UTR全长及pGL3-COX23’UTR不同截短体,荧光素酶报告系统表明COX2 3’UTR对基因表达具有较强的调控作用。而在炎症因子IL-1β的刺激下,pGL3-COX2 3’UTR全长荧光素酶的活性明显升高。结论:成功构建了COX2 mRNA 3’UTR荧光素酶报告基因载体并证明在IL-1β的刺激下COX2表达上调,参与转录后调控。

PDPK13′UTR双荧光素酶报告载体的构建及与gga-miR-148a-5p的靶向验证

本试验通过构建PDPK1基因3′UTR双荧光素酶报告载体,并验证gga-miR-148a-5p与PDPK1的靶向关系。利用生物信息学软件预测gga-miR-148a-5p与PDPK1结合位点;利用PCR扩增PDPK1基因3′UTR序列,将其克隆到PGL3-CMV-LUC-MCS双荧光素酶报告基因载体中;将gga-miR-148a-5p及阴性对照分别与野生型gga-PDPK1-WT-3′UTR双荧光素酶报告质粒共转染至293T细胞中,双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。Targetscan、miRbase数据库预测结果显示,gga-miR-148a-5p与PDPK1基因3′UTR存在互补结合位点;酶切及测序结果表明,双荧光素酶报告载体构建成功;荧光素酶活性试验结果表明,gga-miR-148a-5p mimics能够与PDPK1基因3′UTR结合并抑制荧光素酶活性。gga-miR-148a-5p能够与PDPK1靶向性结合,PDPK1是gga-miR-148a-5p的靶基因。

基于FAP基因启动子的心肌纤维化药物筛选系统的建立与验证

目的建立以成纤维细胞激活蛋白(FAP)基因启动子为响应元件的新双荧光素酶报告基因系统建的心肌纤维化防治药物筛选方法。方法体外扩增小鼠FAP基因启动子片段,克隆至psiCHECK2质粒替换HSV-TK启动子,获得新的重组质粒psiCHECK2-FAP。重组质粒经限制性内切核酸酶HindⅢ消化后,进行琼脂糖凝胶电泳鉴定并纯化片段测序验证;将psiCHECK2-FAP瞬时转染至小鼠心肌成纤维细胞(MCF)培养24 h后,分别给予转化生长因子β1(TGF-β1)5μg·L^(-1),血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)1μmol·L^(-1)或棕榈酸(PA)100μmol·L^(-1)处理0,12,24和48 h,双荧光素酶报告基因实验检测荧光素酶活性。将psiCHECK2-FAP瞬时转染至MCF细胞培养24 h后,达格列净(Dapa)1μmol·L^(-1)预处理1 h,再分别添加TGF-β1(5μg·L^(-1)),AngⅡ(1μmol·L^(-1))或PA(100μmol·L^(-1))处理24 h,双荧光素酶报告基因实验检测荧光素酶活性,Western印迹法检测MCF细胞中Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)和ColⅢ的蛋白表达。结果HindⅢ将psiCHECK2-FAP切成2个片段且条带大小符合预期,测序结果与理论序列完全一致。与空白对照组相比,TGF-β1,AngⅡ和PA组均可显著增加MCF细胞中ColⅠ和ColⅢ表达(P<0.05,P<0.01);分别与TGF-β1,AngⅡ或PA组相比,Dapa干预后则显著降低ColⅠ和ColⅢ表达(P<0.05,P<0.01);与空白对照组相比,TGF-β1,AngⅡ或PA均可显著增加荧光素酶活性(P<0.05,P<0.01),24 h达最大值;分别与TGF-β1,AngⅡ或PA相比,Dapa干预后则显著降低荧光素酶活性(P<0.05,P<0.01)。结论以FAP基因启动子为响应元件的新双荧光素酶报告基因系统在MCF细胞中对促心肌纤维化因子表现出较好的敏感性,为心肌纤维化防治药物的研发提供策略。

一种适于家蚕细胞激素研究的双荧光素酶报告基因系统的内参质粒的构建(英文)

双荧光素酶报告基因系统能够提供灵敏的读数,但该系统需要依赖组成型表达的内参对读数进行归一化。然而,大多数内参并不是在所有条件下都组成型表达。为此,文中建立了一个有效的方法制备适于家蚕细胞双荧光素酶报告基因系统的内参质粒。首先,突变BmV gP78启动子上的激素应答相关元件,获得了在家蚕细胞中稳定表达的组成型启动子BmV gP78M;然后,用BmV gP78M替换pRL-SV40质粒上的SV40启动子和嵌合内含子序列,成功构建了pRL-V gP78M内参质粒;最后,通过细胞转染实验证实pRL-V gP78M内参在家蚕细胞系中稳定表达,并且pRL-V gP78M内参的表达活性不受蜕皮激素、保幼激素及激素相关转录因子的影响。最终,获得了在家蚕细胞中稳定表达且表达量适中的内参质粒pRL-V gP78M。该内参可以有效地作为双荧光素酶报告基因系统的内参质粒用于家蚕细胞系中激素的研究。同时,该内参质粒的构建方法也为构建适于其他物种细胞系的双荧光素酶报告基因系统的内参质粒提供了参考。