NOTCH1基因3＇-UTR段双荧光素酶报告载体的构建及其活性鉴定

目的:构建含NOTCH1基因3'-UTR段双荧光素酶报告载体,并验证其活性。方法:使用PCR方法扩增含NOTCH1基因3'-UTR区序列,插入到双酶切的双荧光素酶报告载体中;使用生物信息学方法预测可能与NOTCH1基因3'-UTR相互作用的miRNA;使用lipofectamine 2000转染试剂将重组质粒或空质粒和miR-34a inhibitor或control真核表达载体共转染HEK293T细胞,双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。结果:得到含NOTCH1基因3'-UTR(1 648 bp)序列的双荧光素酶报告重组质粒,并用凝胶电泳和基因测序的方法验证。NOTCH1基因3'-UTR上可能有miR-34a的调控作用靶点;用重组质粒和miR-34a inhibitor共转染的HEK293T组的荧光素酶活性比空质粒组高45%。结论:含NOTCH1基因3'-UTR双荧光素酶报告载体构建成功,miR-34a对NOTCH1基因有调控作用。

TGFβR3基因3’UTR双荧光素酶报告载体的构建及其与miR-let-7a靶向关系的验证

目的:构建Ⅲ型转化生长因子β受体(TGFβR3)基因3’非编码区(3’UTR)双荧光素酶报告载体,并分析其与miR-let-7a的靶向关系。方法:根据micro RNA靶基因预测软件targetscan获取miR-let-7a与TGFβR3基因3’UTR潜在的互补结合位点;PCR扩增出TGFβR3基因3’UTR序列并克隆至pGEM-T载体,定点突变潜在互补结合位点后双酶切pGEM-T载体获取目的片段并插入至双荧光素酶报告载体获得野生型和突变型重组双荧光素酶报告载体,测序鉴定;将2种载体分别与miR-let-7a mimics或miR-let-7a NC共同转染HEK293T细胞,收集细胞后通过双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。结果:经测序鉴定成功构建野生型和突变型重组荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告系统检测显示,共转染miR-let-7a mimics和野生型双荧光素酶报告载体的荧光素酶活性比miR-let-7a NC组明显降低(P<0.05),而共转染突变型双荧光素酶报告载体后其荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论:成功构建TGFβR3基因3’UTR双荧光素酶报告载体,并证实TGFβR3基因是新发现的miR-let-7a直接靶向调控基因。

KLF3基因3′-UTR区双荧光素酶报告载体及其突变载体的构建与活性鉴定

试验旨在构建锌指蛋白3(KLF3)基因3′-UTR区双荧光素酶基因报告载体及其突变载体,初步分析可能调控KLF3基因表达的miRNAs。首先通过PCR方法扩增KLF3基因的3′-UTR序列,将其克隆到经XhoⅠ、NotⅠ双酶切的双荧光素酶报告载体中;运用Targetscan软件预测可能与KLF3基因3′-UTR相互作用的miRNA;使用脂质体2000转染试剂将miRNAs mimics与构建好的KLF3基因3′-UTR段双荧光素酶报告载体或突变载体共转染于常规培养的293T细胞中,检测荧光素酶活性。结果表明,KLF3基因3′-UTR可能是miR-21的作用靶位点;双荧光报告显示,miR-21 mimics组(0.6900±0.0144)比突变组(1.000±0.0688)和空白对照组(1.000±0.0159)KLF3基因3′-UTR双荧光素酶基因报告载体和突变载体的活性降低了31%(P<0.01)。本试验成功构建了含有KLF3基因3′-UTR段双荧光素酶基因报告载体与突变载体,初步证实miR-21对KLF3基因有调控作用。

HMGA23'-UTR双荧光素酶报告载体构建及与miR-33b-5p的靶向验证

目的:构建野生型及突变型HMGA2基因3’-非编码区(3’-UTR)的双荧光素酶报告基因载体,验证miR-33b-5p与HMGA2之间的靶向关系。方法:生物信息学相关软件预测miR-33b-5p与HMGA2之间的靶向关系;PCR扩增HMGA2的基因片段,构建HMGA2野生型和突变型双荧光素酶报告载体;将miR-33b-5p和阴性对照物分别与野生型GV272-HMGA2-wt-3’-UTR或突变型GV272-HMGA2-mut-3’-UTR双荧光素酶报告载体共转染293T细胞,然后检测荧光素酶的活性。结果:成功构建野生型及突变型HMGA2基因3’-非编码区(3’-UTR)的双荧光素酶报告基因载体,双荧光素酶报告系统的结果显示,加入miR-33b-5p可使野生型GV272-HMGA2-wt-3’-UTR的荧光素酶活性降低,但突变型GV272-HMGA2-mut-3’-UTR的荧光素酶活性与对照组相比则未发生显著变化。结论:野生型及突变型HMGA23’-UTR双荧光素酶报告载体构建成功;miR-33b-5p与HMGA2之间存在靶向关系。

FBXO47 3'-UTR双荧光素酶报告载体构建及与miR-33b-5p靶向验证

[目的]构建FBXO47基因3'-UTR双荧光素酶报告载体,并验证miR-33b-5p与FBXO47的靶向关系。[方法]采用生物信息学软件预测miR-33b-5p与FBXO47结合位点;利用PCR扩增FBXO47基因3'-UTR序列,将其克隆到GV272载体中,构建FBXO47野生型及突变型双荧光素酶报告质粒;将miR-33b-5p或阴性对照分别与野生型GV272-FBXO47-wt 3'-UTR或突变型GV272-FBXO47-mut 3'-UTR双荧光素酶报告质粒共转染至293T细胞中,双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。[结果]酶切及测序结果表明,野生型GV272-FBXO47-wt 3'-UTR及突变型GV272-FBXO47-mut 3'-UTR双荧光素酶报告载体构建成功;荧光素酶活性结果表明,相较于对照组,miR-33b-5p可使野生型GV272-FBXO47-wt 3'-UTR的荧光素酶活性降低66%左右;而定点突变GV272-FBXO47-mut 3'-UTR的荧光素酶荧光素酶活性没有显著变化。[结论]成功构建了FBXO47基因3'-UTR的荧光素酶报告基因载体,miR-33b-5p与FBXO47存在靶向性。

CXCR4-3’-UTR双荧光素酶报告基因载体的构建及与microRNA-494的靶向作用

目的 构建野生型与突变型CXCR4基因3’-非编码区(3’-UTR)的双荧光素酶报告基因载体,验证microRNA-494 (miR-494)对CXCR4的靶向调控作用。方法 使用生物信息学相关软件预测miR-494与CXCR4之间的靶向关系;利用PCR法扩增CXCR4的目的基因片段构建野生型与突变型CXCR4基因3’-UTR的双荧光素酶报告基因载体;将miR-494模拟物和阴性对照物分别与野生型pMIR-CXCR4-wt-3’-UTR或突变型pMIR-CXCR4-mut-3’-UTR双荧光素酶报告基因载体共同转染NRK-49F细胞,然后进一步检测相对荧光值。结果 成功构建野生型与突变型CXCR4基因3’-UTR的双荧光素酶报告基因载体,荧光结果显示加入miR-494模拟物可使野生型pMIR-CXCR4-wt-3’-UTR的荧光素酶活性降低约52%,但突变型pMIR-CXCR4-mut-3’-UTR的荧光素酶活性与对照组相比无显著变化。结论 初步证实miR-494与CXCR4之间存在靶向调控关系。

CUL53’-UTR双荧光素酶报告载体构建及与MiR-148a-3p靶向验证

目的 :构建CUL5基因3’-UTR双荧光素酶报告载体,并验证miR-148a-3p与CUL5的靶向关系。方法 :利用生物信息学软件预测miR-148a-3p与CUL5结合位点;利用PCR扩增CUL5基因3'-UTR序列,将其克隆到pmiR-RB-Report TM双荧光素酶报告基因载体中,同时构建CUL5 3’UTR突变载体;将miR-148a-3p及阴性对照分别与野生型has-CUL5-wt 3'-UTR及突变型has-CUL5-mut 3'-UTR双荧光素酶报告质粒共转染至293T细胞中,双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。结果 :Targetscan、PicTar、miRanda、PITA、miRDB数据库预测结果显示,miR-148a-3p与CUL5基因3’UTR存在互补结合位点。酶切及测序结果表明,双荧光素酶报告载体构建成功;荧光素酶活性实验表明,miR-148a-3p mimics能够与CUL5基因3′UTR结合并抑制荧光素酶活性;对其预测靶位点进行突变后,突变型载体中的报告荧光活性有所上升。结论 :miR-148a-3p能够与CUL5靶向性结合,CUL5是miR-148a-3p新的靶基因。

ERG基因3'端非翻译区荧光素酶报告载体的构建及其活性

目的构建人ERG基因3'端非翻译区(3'UTR)双荧光素酶报告载体,为研究ERG基因的转录后调控提供实验基础。方法以基因组DNA为模板PCR扩增ERG的3'UTR序列,并连接到psi CHECK2双荧光素酶报告载体的多克隆位点,测序鉴定psi CHECK2-ERG载体构建是否成功。通过生物信息学预测ERG 3'UTR具有miR-145-5p的结合靶点。通过共转染miR-145-5p模拟物和psi CHECK2-ERG载体,检测荧光素酶的活性,以共转染miR-145-5p模拟物对照和psi CHECK2-ERG载体作为参照。结果构建了含有ERG 3'UTR序列的双荧光素酶报告系统,酶切电泳和基因测序证实序列与目标一致。miR-145-5p模拟物和报告质粒共转染者荧光素酶活性明显下降(28.39%,P<0.05)。结论含有ERG 3'UTR的双荧光素酶报告载体构建成功。初步鉴定miR-145-5p作用ERG基因3'UTR,对ERG发挥转录后水平调控作用。

牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因载体构建与活性检测

【目的】构建牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并检测其在C2C12细胞系中的表达活性。【方法】从牛外周血中提取基因组DNA,通过PCR方法从牛基因组DNA中克隆获得牛ATP5B基因的5′端转录调控区的1 898bp目的片段,通过设计引物逐段缺失后获得7个亚克隆,将其纯化后经SmaⅠ和KpnⅠ双酶切与pGL3-Basic载体连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,得到牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,经脂质体基因转染法转染C2C12细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶活性;运用在线软件Gen-omatix和TFSEARCH对ATP5B启动子区序列进行分析。【结果】成功克隆获得7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pATP5B-992、pATP5B-678、pATP5B-462和pATP5B-145;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,可知构建的重组质粒均有启动子活性,且重组质粒pATP5B-678和pATP5B-462与空载体pGL3-Basic的荧光素酶活性差异极显著。软件分析结果显示,ATP5B基因启动子区域-763^-85bp存在多个重要转录调控元件。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且证实-763^-230bp为牛ATP5B基因的核心启动子区域。

大鼠Prestin-3'UTR双荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定

目的构建大鼠Prestin基因(SLC26A5)3'端UTR区双荧光素酶报告系统,为研究Prestin基因的microRNA调控提供基础平台。方法以C6细胞基因组DNA为模板PCR扩增SLC26A5基因的3'UTR序列,并连接至pmri-RBREPORTTM双荧光素酶报告载体多克隆位点,测序验证插入序列并转染入293T细胞检测其荧光素酶活性。结果测序结果表明PMIR-3'UTR的插入序列正确,在转染入293T细胞后其荧光素酶能正常表达。结论大鼠Prestin-3'UTR双荧光素酶报告基因载体构建成功。

COL4A3基因3'UTR双荧光素酶报告基因载体构建及其与miR-299靶向关系验证

目的探讨双荧光素酶报告基因载体构建并鉴定微小RNA-299(miR-299)与Ⅳ型胶原α3链(COL4A3)基因的靶标关系,为miR-299调控COL4A3基因影响干细胞成软骨分化研究奠定基础.方法2018年3月至2018年12月,利用生物信息学方法预测miR-299与COL4A3-3'UTR区(3'端非翻译区)的潜在结合位点,并通过PCR法扩增COL4A3-3'UTR野生和突变序列,将其克隆至psiCHECK-2质粒中构建相应载体,载体鉴定采用酶切法和基因测序法.细胞复苏、扩增并转染,转染分4组,每组3孔,分别为:①COL4A3-WT加miR-299/NC.②COL4A3-WT加miR-299-inhibitor/NC-inhibitor.③COL4A3-MUT加miR-299/NC.④COL4A3-MUT加miR-299-inhibitor/NC-inhibitor;采用双荧光素酶检测试剂盒测定各组荧光素酶活性并行t检验比较组间差异,P<0.05为差异有统计学意义.结果酶切及DNA测序结果显示psiCHECK-2-COL4A3双荧光素酶报告基因载体构建成功.Luciferase检测显示:野生型COL4A3基因组间比较,miR-299转染组(R/F均值为59.38%)较NC组(R/F均值为100%)荧光素酶活性下降,组间差异有统计学意义(P<0.05);野生型COL4A3基因加inhibitor后组间比较,miR-299-inhibitor组(R/F均值为153.98%)较NC-inhibitor组(R/F均值为100%)荧光素酶活性上升,组间差异有统计学意义(P<0.05);突变型COL4A3基因组及突变型组加入inhibitor后组间比较,miR-299转染组(R/F均值为102.09%)及miR-299-inhibitor组(R/F均值为108.51%)较对应NC组(R/F均值为104.70%)及NC-inhibitor组(R/F均值为105.13%)比较,荧光素酶活性差异均无统计学意义(P>0.05).结论COL4A3基因3'UTR双荧光素酶报告基因载体构建成功,并通过双荧光素酶实验进一步验证了miR-299直接作用于靶基因COL4A3-3'UTR区域的真实性.

Ddit43′UTR双荧光素酶报告基因质粒的构建及调控microRNA的鉴定

目的构建Ddit4基因双荧光素酶报告基因质粒,并验证miR-222-3p与Ddit4的靶向调控关系。方法利用生物信息学软件预测miR-222-3p与Ddit4的结合位点;PCR扩增Ddit43′UTR序列,将其克隆至双荧光素酶GPmiRGLO报告基因载体中,同时构建Ddit43′UTR突变载体;将miR-222-3p、双荧光素酶报告质粒野生型和突变型mmu-Ddit43′UTR共转染至HT-22细胞中,酶标仪检测双荧光素酶荧光值。结果生物信息数据库预测结果显示,miR-222-3p与Ddit4基因3′UTR存在互补结合位点,载体测序证实双荧光素酶Ddit4报告载体构建成功;双荧光素酶试验表明,miR-222-3p mimics能够与野生型Ddit4基因3′UTR靶向结合并降低其荧光值,将靶位点进行突变后,其荧光值有所上升。结论miR-222-3p与Ddit4基因3′UTR互补结合实现了其对Ddit4靶向调控的作用;miR-222-3p可能通过调控Ddit4进而参与NTDs的发生发展。

miR-663通过靶向TGF-β1调控羊驼黑色素细胞的黑色素生成

【目的】预测和验证羊驼TGF-β1是mi R-663的靶基因之一,并对mi R-663介导的TGF-β1在黑色素生成过程中的作用进行研究。【方法】利用Targetscan、RNAhybrid和RNA22在线预测mi R-663的靶基因,并对靶基因3′UTR区可能的mi R-663的作用位点进行分析。利用DNAMAN软件分析比对羊驼、人和牛等哺乳动物TGF-β1-3′UTR区的相似性。利用SacⅠ和XbaⅠ将羊驼TGF-β1基因的3′UTR区插入pmir GLO构建双荧光报告载体pmir GLO-TGF-β1-3′UTR并与mi R-663 mimic共转染293T细胞,通过测定荧光素酶活性来验证mi R-663的直接靶基因是TGF-β1。在羊驼黑色素细胞中通过转染mi R-663 mimic来过表达mi R-663,并利用q RT-PCR和Western blotting检测mi R-663过表达后细胞中TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7和β-catenin分别在m RNA和蛋白水平的变化及黑色素含量的变化。【结果】软件预测显示mi R-663有68个保守的靶基因,包含74个保守的靶位点和44个非保守靶位点。TGF-β1是mi R-663的靶基因之一,且已被证明与毛囊发育和黑色素生成相关。不同物种的TGF-β1基因的3′UTR区相似性较高且均存在多个保守的mi R-663靶位点。克隆了羊驼TGF-β1基因3′UTR区发现存在3个保守的mi R-663靶位点。成功构建包含3个mi R-663作用位点的pmir GLO-TGF-β1-3′UTR双荧光报告载体并与mi R-663 mimic共转染293T细胞。双荧光素酶报告基因检测结果显示:与对照组相比,试验组pmir GLO-TGF-β1-3′UTR+mi R-663 mimic荧光素酶活性下调31.01%,表明TGF-β1是mi R-663直接的靶基因。在羊驼黑色素细胞中转染mi R-663 mimic后:mi R-663表达量上调334倍,TGF-β1、β-catenin、Smad4基因的表达量分别下调89%、41%、34%;TGF-β1蛋白表达量下降了21%,β-catenin蛋白表达量无明显差异;黑色素细胞中的黑色素含量下降42%。【结论】TGF-β1是mi R-663的直接靶基因。mi R-663通过调控TGF-β1的表达而影响TGF-β/Smad和Wnt信号通路,进而影响羊驼黑色素细胞中的黑色素生成。

麒麟鸡Frizzled4基因的miRNA筛选及验证载体构建

研究利用生物信息学方法选出调控Fzd4基因的miRNAs,且利用q RT-PCR方法检测了卷羽麒麟鸡和片羽怀乡鸡中miRNAs和Fzd4基因表达水平,进一步构建了Fzd4基因双荧光素酶报告基因pmir Glo载体,为后期在细胞水平验证miRNA和Fzd4靶标关系提供条件。结果显示:Fzd4基因的CDS区存在miRNA-1458(mi R-1458)和miRNA-1623(mi R-1623)靶标结合位点,与经典的调控机制有所不同,其3′UTR存在miRNA-184-3p(mi R-184-3p)结合位点;相对于怀乡鸡,麒麟鸡皮肤中mi R-1458、mi R-1623和Fzd4基因表达水平极显著升高(P<0.01),而mi R-184-3p表达量极显著降低(P<0.01);构建了Fzd4基因双荧光素酶报告载体,为细胞水平研究其具体调控机制奠定基础。研究表明Fzd4基因的关键miRNA为mi R-184-3p以及Fzd4基因双荧光素酶报告载体的构建为进一步研究其在毛囊生长发育过程的作用奠定基础。

苦荞叶肉细胞原生质体的分离纯化及瞬时转化

高效分离原生质体是遗传转化、细胞融合和再生培养的基础性工作。该实验以苦荞（Fagopyrum tartaricum）品种‘榆6-21’的叶肉细胞为材料,研究了酶类组合、甘露醇浓度、酶解时间以及离心速度对苦荞叶肉细胞原生质体分离纯化的影响。结果表明：酶解液组成为1.5%纤维素酶R-10＋0.5%离析酶R-10＋0.5mol/L甘露醇＋20mmol/L MES＋20mmol/L KCl＋10mmol/L CaCl2＋0.1%牛血清白蛋白,以第5~7片真叶为材料,用胶带纸撕去叶片下表皮后,25℃黑暗酶解4h,以900r/min离心收集,可以获得高质量的原生质体,原生质体产量可达6×106个/g,活力达到90%以上;用双荧光素酶报告基因载体检测原生质体的转化效率,以分离纯化的苦荞叶肉细胞原生质体为受体,将双荧光素酶报告基因载体与其混合后,在终浓度为20%PEG4000介导下,黑暗转化20min,可以检测到较高活性的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶,证明双荧光素酶报告载体可成功转化到原生质体中。研究结果为苦荞原生质体瞬时转化及遗传操作提供了技术基础。

牛MYOZ1基因启动子活性分析

【目的】鉴定牛MYOZ1基因转录起始位点,确定牛MYOZ1基因核心启动子区域,为进一步研究牛MYOZ1基因的转录调控机制奠定基础。【方法】以秦川牛肌肉5′RACE准备cDNA为模板,设计5′RACE扩增试验,确定牛MYOZ1基因转录起始位点。以秦川牛外周血基因组DNA为模板,通过PCR克隆获得牛MYOZ1基因转录调控区-1 628/+61目的片段。通过生物信息学分析软件预测可能包含的转录因子结合位点,设计逐段缺失引物,获得7个亚克隆,将其分别与pGL3-Basic载体连接,得到牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,通过脂质体法转染C2C12细胞系,检测7个重组质粒的荧光素酶活性,分析启动子活性。【结果】确定了牛MYOZ1基因的转录起始位点,成功克隆获得7个系列缺失的牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒:pMYOZ1-1 628/+61、pMYOZ1-1 430/+61、pMYOZ1-1 179/+61、pMYOZ1-932/+61、pMYOZ1-676/+61、pMYOZ1-437/+61和pMYOZ1-116/+61,其中重组质粒pMYOZ1-116/+61启动子活性极显著高于pGL3-Basic,推测牛MYOZ1基因-116/+61区域可能包含核心启动子;重组质粒pMYOZ1-1 628/+61启动子活性极显著高于pMYOZ1-1 430/+61片段活性(P<0.01),表明牛MYOZ1基因启动子区域-1 628/-1 430片段可能包含启动子活性增强元件。生物信息学分析发现,牛MYOZ1基因启动子-116/+61片段可能包含SP1、GC Box、CAAT等多个重要转录因子结合位点;-1 628/-1 430片段可能包含SP1、MyoD等多个重要转录因子结合位点。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且初步确定了牛MYOZ1基因的核心启动子区域位于-116/+61。

miR-20b直接靶向3′-UTR负性调节VEGF的表达

目的探讨miR-20b是否直接靶向VEGF 3′-非编码区(3′-UTR)而调控其表达。方法采用miRanda软件预测VEGF 3′-UTR是否存在miR-20b的结合位点;使用PCR方法扩增RAW264.7细胞VEGF基因3′-UTR序列,经双酶切后克隆到pmiR-RB-Report^(TM)质粒海肾荧光素酶的下游,得到pmiR-RB-Report TM-VEGF 3′-UTR双荧光素酶重组质粒,使用电泳法和测序法进行验证;将重组质粒或空质粒与miR-20b模拟物或其对照共转染HeLa细胞,24h后检测相应荧光素酶活性。结果 VEGF 3′-UTR存在miR-20b的结合位点;获得了含VEGF 3′-UTR的双荧光素酶报告载体;重组质粒与miR-20b模拟物共转染组HeLa细胞的荧光素酶活性明显低于空质粒转染组(P<0.05)。结论成功构建小鼠VEGF基因3′-UTR双荧光素酶报告载体,miR-20b可以直接靶向VEGF 3′-UTR而负性调控其表达。

靶向猪CLTC基因miRNA的预测与验证

网格蛋白介导的胞吞是病毒侵入细胞的重要途径,网格蛋白重链(clathrin heavy chain,CLTC)是形成网格蛋白小窝结构的重要组成部分。针对CLTC基因的转录后调控特别是调控猪Sus scrofa CLTC的miRNA目前还不太清楚。本研究旨在筛选出调控猪CLTC基因的miRNA。利用生物信息学方法预测出6个靶向猪CLTC基因的miRNA,将猪CLTC基因3′UTR克隆至双荧光素酶报告基因载体psi CHECK2中获得双荧光素酶报告基因重组载体psi CHECK2-CLTC-3′UTR。将预测得到的miRNA分别和重组载体psi CHECK2-CLTC-3′UTR共转染到细胞中,以乱序序列作为阴性对照(NC),检测miRNA对重组质粒荧光素酶活性的影响。结果发现miR-205,miR-1,miR-129-5p和miR-206均能够显著抑制荧光素酶活性(P<0.05)。在猪肾上皮细胞系PK15细胞中超表达miR-1和miR-129-5p后,定量PCR(q-PCR)结果显示:猪CLTC基因的表达量显著下调。突变了psi CHECK2-CLTC-3′UTR载体中这4个miRNA的种子序列的结合位点发现:miR-1对突变质粒中的荧光素酶无显著抑制作用。表明miR-1与猪CLTC基因有直接的靶向关系,并通过其种子序列抑制CLTC基因的表达。

miR-566与miR-1183靶向抑制RHD基因表达的研究

目的探讨Rh血型系统RHD基因表达相关微小RNA(miRNA),及其在干预RHD基因表达中的作用。方法利用生物信息学软件TargetScan、PicTar和miRWalk预测靶向作用于RHD基因的miRNA,综合3个数据库的结果选取靶标率最高的5个miRNA进行研究。聚合酶链反应(PCR)扩增RHD基因3′-非编码区(3′-UTR)序列,插入到双酶切的双荧光素酶报告基因载体中,将报告基因载体与miRNA共转染细胞,通过相对荧光素酶活性分析测定miRNA对RHD基因的靶向作用。采用实时荧光定量PCR检测miRNA在RhD阳性及“弱D”表型样本中的表达。结果成功构建RHD基因3′-UTR双荧光素酶报告基因载体。该报告基因载体与miRNA-566、miR-1183和miR-1207共转染细胞的相对荧光素酶活性与对照比较分别下降了37%(P<0.05)、13%(P<0.05)和14%(P<0.05),提示miRNA-566、miR-1183和miR-1207潜在靶向调控RHD基因。miRNA-566和miR-1183在“弱D”表型样本中的相对表达量显著高于RhD阳性样本(P<0.05)。结论RHD基因3′-UTR双荧光素酶基因报告载体构建成功。miR-566和miR-1183对RHD基因有靶向抑制作用。

猪VEGFA 3′UTR生物信息学分析及其与miR-361-5p的靶向验证

为了扩增并分析猪卵泡颗粒细胞中血管内皮生长因子A(VEGFA)基因3编码区(3′UTR)序列、构建VEGFA 3′UTR荧光素酶报告质粒以及利用双荧光素酶报告基因验证miR-361-5p与VEGFA 3′UTR的靶向关系,试验通过RT-PCR扩增VEGFA 3′UTR,并用生物信息学方法分析预测其保守性及潜在的互作miRNA,最后将扩增的VEGFA 3′UTR序列克隆至荧光素酶报告载体中,与miR-361-5p mimics(试验组)或NC mimics(对照组)共同转染293细胞,通过双荧光素酶报告系统检测两组细胞的荧光素酶活性,从而鉴定miR-361-5p与VEGFA 3′UTR的靶向关系。结果表明:在猪卵泡颗粒细胞中成功扩增了VEGFA基因3′UTR序列,其在哺乳动物中保守性较高,有多个潜在miRNA结合位点;成功构建了VEGFA基因3′UTR荧光素酶报告质粒,证明了miR-361-5p可以直接作用于VEGFA基因3′UTR,抑制其荧光素酶活性。