用双萤光素酶报告基因技术验证小鼠lncRNA-H19与miR-199a-5p的靶向关系

目的:构建长链非编码RNA-H19(lncRNA-H19)萤光素酶报告质粒,利用双萤光素酶报告基因技术验证小鼠lncRNA-H19与微小RNA-199a-5p(miR-199a-5p)的靶向关系。方法:通过生物信息学网站RegRNA2.0预测获取小鼠lncRNA-H19与miR-199a-5p潜在的互补结合位点。将H19及其突变体克隆到萤光素酶载体psi CHECK-2中,构建H19野生型和突变型质粒,并采用酶切和测序方法鉴定psi CHECK-2-H19载体是否构建成功。将H19野生型和突变型质粒分别与miR-199a-5p模拟物、miR-199a-5p抑制剂、miR-199a-5p模拟物阴性对照或miR-199a-5p抑制剂阴性对照在293T细胞中共转染。收集细胞后通过双萤光素酶报告系统检测不同组别的萤光素酶活性,从而对lncRNA-H19与miR-199a-5p的靶向调节关系进行验证。结果:构建的重组萤光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确,双萤光素酶报告基因检测显示,与miR-199a-5p模拟物阴性对照组相比,miR-199a-5p模拟物组H19野生型报告基因的萤光素酶活性显著降低,下降约49%左右(P<0.01),而miR-199a-5p抑制剂组H19野生型报告基因的萤光素酶活性较miR-199a-5p模拟物组明显增高(P<0.01)。miR-199a-5p模拟物、miR-199a-5p抑制剂、miR-199a-5p模拟物阴性对照以及miR-199a-5p抑制剂阴性对照对H19突变型的萤光素酶活性均无明显影响。结论:lncRNA-H19能够靶向结合miR-199a-5p,并在转录后水平对其有直接抑制作用。

利用双萤光素酶报告基因系统筛选有效的siRNA

目的建立一种利用双萤光素酶报告基因系统筛选能有效抑制目的基因表达的小干扰RNA(siRNA)的方法。方法以绿色荧光蛋白(GFP)基因为研究对象,构建3个候选的靶向GFP的siRNA表达质粒pSi-GFPsiRNA1、pSi-GFPsiRNA2、pSi-GFPsiRNA3和阴性对照pSi-Negative。构建拥有同一Kozak共有翻译启始序列、翻译启始密码子ATG的GFP与萤光素酶基因(LUC)的融合表达载体pGL3-GFPf。将包含3个GFPsiRNA靶序列的GFP片段插入到改建过的pGL3-promoter载体上LUC的3'非翻译区(UTR),构建pGL3-GFPp。将GFPsiRNA表达质粒联同内参照质粒pRL-TK分别与pGL3-GFPf、pGL3-GFPp共转化HEK293细胞。利用双萤光素酶检测试剂盒测定各组细胞中萤光素酶的活力水平,用荧光定量PCR检测各组细胞中GFPmRNA的表达水平。结果同对照组相比,与pGL3-GFPf共转化GFPsiRNA表达质粒的各组细胞中萤火虫萤光素酶/海肾萤光素酶比值明显降低,其中GFPsiRNA1表达组中降低最显著(P<0.01);定量PCR检测也显示,GFPsiRNA1表达组中GFPmRNA的表达水平降低最明显(P<0.01)。双萤光素酶活性检测和定量PCR结果还显示,与pGL3-GFPp共转化GFPsiRNA表达质粒的各组细胞中,GFPsiRNA1抑制GFP的表达最显著(P<0.01)。结论本文建立了通过双萤光素酶活性检测来筛选有效的siRNA的方法,并为进行多个基因的有效siRNA的筛选提供解决方案。

用于鉴定microRNA靶基因的新型双萤光素酶报告基因系统的构建及应用

目的:构建用于鉴定microRNA靶基因的报告基因系统。方法:在pGL3-Basic载体的luc基因上游插入CMV启动子,下游插入用于克隆靶基因3'UTR的多克隆位点,构建报告基因载体pMIR-luciferase;将pMIR-lu-ciferase载体的luc基因替换成Rluc基因,构建内参载体pMIR-control;将补体因子H(CFH)的3'UTR插入pMIR-luciferase载体的多克隆位点处,构建含有CFH 3'UTR的报告基因载体;用pIRES2-EGFP载体构建microRNA146a真核表达载体;将含有CFH 3'UTR的报告基因载体、microRNA146a真核表达载体及内参载体共转染HepG2细胞,进行报告基因的活性检测。结果:构建了报告基因载体、内参载体和microRNA146a真核表达载体,经酶切和测序鉴定正确;microRNA146a真核表达载体转染细胞72 h后,经荧光显微镜观察确认载体转染及表达;用实时定量PCR检测,microRNA146a的表达水平显著上调(P<0.01);用构建的报告基因系统检测,结果表明microRNA146a显著地抑制了含CFH 3'UTR的报告基因的活性(P<0.05)。结论:构建了一种新型的报告基因载体系统,该系统可用于miRNA靶基因的鉴定。

利用双萤光素酶报告系统研究FoxM1转录活性调控

目的:构建细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)启动子萤光素酶报告系统,用于转录因子FoxM1转录活性调控研究。方法:利用瞬时转染、实时荧光定量PCR及Western印迹,验证人胚肾HEK293细胞中FoxM1对Cyclin B1 mRNA的转录及蛋白表达的调节作用;利用PCR技术从人宫颈癌HeLa细胞基因组中钓取人源Cyclin B1的启动子序列,克隆至pGL3-Basic Vector中,构建含有Cyclin B1启动子的萤火虫萤光素酶报告质粒pGL3-Cyclin B1;通过瞬时转染、Western印迹及萤火虫/海肾萤光素酶双报告系统,研究c-Abl酪氨酸激酶对FoxM1转录活性的调控作用。结果:构建了Cyclin B1萤火虫萤光素酶报告系统,该报告系统可用于FoxM1转录活性研究;c-Abl酪氨酸激酶能够显著抑制FoxM1靶向Cyclin B1启动子的转录活性,且抑制作用依赖c-Abl的激酶活性。结论:pGL3-Cyclin B1萤光素酶报告系统可用于研究c-Abl酪氨酸激酶介导的FoxM1转录活性调节。

用于筛选shRNA的新型双萤光素酶报告基因载体的构建及应用

目的:构建一个新型双萤光素酶报告基因载体用于准确高效地筛选有效抑制靶基因表达的shRNA。方法:采用PCR、定向克隆、基因重组等分子生物学方法,将双萤光素酶报告基因系统中需要的报告基因载体、shRNA真核表达载体和内参载体三个功能,整合于一个新型的双萤光素酶报告基因载体pFLuc-C-TK-RLuc-shRNA之中。应用该载体对靶向人PD1基因以及Furin基因的shRNA进行干涉效果比较。结果:应用p FLuc-C-TK-RLuc-shRNA载体进行单质粒转染方法与传统的三质粒转染方法均提示shRNA#1对靶基因PD1的抑制效果最优;但是使用新型双萤光素酶报告基因载体检测结果的标准差数值显著低于传统方法。以pFLuc-C-TK-RLuc-shRNA单质粒转染方法得到的各组样品结果的均一性显著提高,能够准确地反映出shRNA#3较shRNA#2具有更强的Furin基因抑制作用;而传统方法未能有效判断二者的差异。结论:新型双萤光素酶报告基因载体简化了操作步骤,降低了传统三质粒共转染方法所引起的检测结果大幅波动,进一步增强了双萤光素酶报告基因系统的信噪比,提高了筛选抑制靶基因表达shRNA的准确性。

Trim5α对TAB2诱导的NFκB启动子荧光素酶报告基因活性的影响

目的构建人Trim5α的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Trim5α,观察其对TAB2诱导的NFκB启动子荧光素酶报告基因活性的影响。方法提取Hela细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增出Trim5α基因编码区全长片段,克隆到5`-Flag-pcDNA3.1(+),经酶切、菌落PCR及测序进行鉴定。转染HEK293T细胞,Western blot检测Trim5α蛋白的表达,双萤光素酶报告基因系统检测Trim5α对TAB2诱导的NFκB报告基因活化的影响。结果经鉴定,成功构建Trim5α表达载体,该载体可在HEK293T细胞中表达Trim5α,Trim5α对TAB2诱导的NFκB报告基因活化无显著影响。结论 Trim5α对TAB2诱导的NFκB报告基因活化未见显著影响,初步建立了Trim蛋白对NFκB报告基因影响的功能筛选平台。

错配修复基因hMLH1启动子萤光素酶报告基因载体的构建与鉴定

目的构建含hMLH1启动子片段的萤光素酶报告基因载体,并检测其在雌激素诱导下的转录活性。方法以正常人基因组DNA为模板,PCR扩增hMLH1启动子片段(-1 953/+53),插入萤光素酶报告基因载体pGL3-Basic,将重组质粒转入HEK293细胞,检测在有和无雌激素诱导下萤光素酶的活性变化。结果酶切和测序结果证实重组萤光素酶报告基因载体pGL3-Promoter1-luc构建成功。转染pGL3-Promoter1-luc后,雌激素诱导的萤光素酶活性为7.45±0.81,显著高于无水乙醇组的3.28±0.19(n=3,P<0.001)。结论 hMLH1启动子片段存在与雌激素相关的调控序列。

丙型肝炎病毒核心蛋白对胞外基质金属蛋白酶诱导物基因转录的影响

目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白对胞外基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN)基因转录的影响。方法:构建HCV核心蛋白真核表达载体和EMMPRIN启动子删除突变体pGL3载体,应用双萤光素酶报告基因系统检测EMMPRIN启动子不同删除突变体的转录活性,并寻找核心蛋白上调EMMPRIN转录相关的关键启动子区段。结果:HCV核心蛋白可以显著上调EMMPRIN的表达;调节EMMPRIN转录的启动子关键区段为+1～435bp,HCV核心蛋白主要通过该关键区段上调EMMPRIN的转录,并呈现剂量依赖性。结论:HCV核心蛋白有可能通过EMMPRIN启动子关键区段上调EMMPRIN的转录,从而上调基质金属蛋白酶,最终导致肝癌转移。

二氢生物蝶呤还原酶基因启动子核心调控区域的定位及研究

目的:前期结果表明QDPR参与糖尿病肾病的发生发展。本研究对QDPR基因启动子核心调控区域定位,分析其转录调控功能。方法:构建含有大鼠QDPR基因翻译起始位点上游2 092 bp序列的萤火虫萤光素酶报告基因重组质粒。生物信息学预测潜在的核心启动子区域,并构建该区域多个片段缺失的萤火虫萤光素酶报告基因重组质粒。分别瞬时转染HEK293T细胞,通过双萤光素酶报告基因活性分析,定位QDPR基因启动子的核心调控序列。结果:与-2 092^-1序列相比,缺失QDPR基因上游-529^-116序列的萤光素酶活性只有原来的1%(P<0.01),而仅保留-529^-1序列的萤光素酶活性是原来的64%(P<0.05)。将QDPR基因上游-529^-116序列逐段缺失后发现,分别缺失-529^-429,-428^-250,-141^-116三段序列的萤光素酶活性都显著升高(P<0.01),而缺失-249^-142序列的萤光素酶活性则显著下降(P<0.05)。结论:大鼠QDPR基因的核心启动子可能位于翻译起始密码子上游-529^-116区域内,该区域内存在多个转录因子Sp1的结合位点,可能是QDPR基因潜在的正性调控区和负性调控区。

靶向调控c-SKI的microRNA的筛选及验证

目的筛选和验证靶向调控c-SKI并与纤维化相关的microRNA(miRNA)。方法生物信息学方法预测并结合文献报道,筛选出靶向c-SKI的候选miRNAs,RT-qPCR检测人心肌成纤维细胞(HCFBs)中候选miRNAs和c-SKI的表达,筛选出抑制作用最显著的miRNA;构建c-SKI-3′-UTR野生型(c-SKI-wt)和突变型(c-SKI-mut)载体,分别与miR-155a-5p/miR-17a-5p的模拟物、抑制剂及对照在人胚肾上皮细胞(HEK293T)中共转染,双萤光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性;接着,分别将miR-155a/miR-17a-5p mimics和inhibitor转染至人心肌成纤维细胞(HCFBs),Western blot检测各组细胞c-SKI的表达。结果 1)经筛选miR-155a-5p和miR-17a-5p对c-SKI的抑制作用最明显(P<0.01);2)与NC组相比,miR-155a-5p/miR-17a-5p mimics组萤光素酶活性均显著下降(P<0.05),miR-155a-5p/miR-17a-5p inhibitor组萤光素酶活性均明显增强(P<0.05);3)与NC组相比,miR-155a-5p/miR-17a-5p mimics组中c-SKI蛋白表达显著下调,miR-155a-5p/miR-17a-5p inhibitor组中c-SKI的表达显著上调(P<0.01)。结论 miR-155a-5p和miR-17a-5p可分别靶向结合c-SKI的3′-UTR,在HCFBs中负性调控c-SKI的表达。

PD-1核心启动子的获得及活性鉴定

目的:构建PD-1(programmed death receptor 1)全长启动子及不同截短体的报告基因,并对其转录活性进行检测。方法:通过PCR及双酶切方法,从人全血基因组DNA中获得PD-1基因编码序列,包含不同长度碱基的PD-1启动子序列,分别克隆到报告基因pGL3-Basic载体上,构建8个不同长度PD-1启动子的报告基因;用脂质体转染法将8个报告基因分别转染至Jurkat细胞系;采用双萤光素酶报告基因系统评估PD-1启动子的活性。结果:经PCR方法扩增出大小分别为1650、1450、1250、1128、874、674、474和274 bp的不同长度的PD-1启动子序列,测序正确(与GenBank报道一致),酶切鉴定正确;瞬时转染Jurkat细胞系后经报告基因检测,8个启动子均具有转录活性。结论:构建了PD-1启动子的报告基因,并证实均有转录活性,且以pGL3-1128活性最高,为PD-1的核心启动子,为进一步研究PD-1的转录调控奠定了实验基础。

NF-κB参与枸橼酸铁铵过载诱导的人肝细胞hepcidin基因表达

目的:研究核因子κB(NF-κB)在枸橼酸铁铵过载诱导人肝细胞铁调素(hepcidin)基因表达中的调控作用。方法:依据前期不同浓度枸橼酸铁铵抑制人肝细胞HH4增殖实验结果,选取0.1、1、5和10 mmol/L枸橼酸铁铵处理人肝细胞HH4 48 h,半定量PCR法检测胞内hepcidin的表达水平;利用染色质免疫共沉淀(Ch IP)、电泳迁移率实验(EMSA)和双萤光素酶报告基因检测系统,并结合胞内NF-κB活性抑制实验,确定NF-κB对人hepcidin转录活性的影响。结果:5 mmol/L和10 mmol/L浓度的枸橼酸铁铵处理细胞后,hepcidin表达水平显著增强;Ch IP和EMSA实验证实NF-κB能够与hepcidin基因启动子结合;重组萤光素酶报告质粒TOPFlash-p Hepcidin相对萤光素酶活性明显高于对照组;与重组质粒TOPFlash-p Hepcidin相比,突变重组萤光素酶报告质粒TOPFlash-p Hepcidin-mut相对萤光素酶活性显著降低;NF-κB抑制剂BAY 11-7082显著降低了hepcidin基因的表达。结论:NF-κB参与了铁过载诱导的人hepcidin基因表达。这为进一步深入研究肝细胞铁过载模式下多因子协同调控hepcidin基因表达的具体分子机理奠定了基础。

缺氧调控人趋化因子受体CCR5启动子区的表达分析

目的:分析人趋化因子受体5(CCR5)基因启动子区序列在缺氧条件下的表达。方法:构建CCR5基因启动子区萤光素酶报告基因载体,转染入MDA-MB-435细胞中,检测分析其双萤光素酶活性。结果:CCR5基因启动子区的pGL3重组质粒在缺氧条件下的MDA-MB-435细胞中能表现出明显的萤光素酶活性。结论:CCR5基因启动区序列中存在缺氧诱导CCR5基因转录的主要上调元件。

斑马鱼ID1启动子体内外活性分析

目的:分析斑马鱼分化抑制因子1(ID1)启动子在体内、外的活性情况,为研究ID1基因表达调控奠定基础。方法:通过构建斑马鱼ID1启动子不同长度萤光素酶报告质粒,分别以鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)和斑马鱼胚胎为材料进行体外转染和体内注射,并采用双萤光素酶报告系统对不同长度ID1启动子活性进行评估。结果:在体内、外实验中,不同长度ID1启动子活性均表现出随启动子长度变化而变化的情况;启动子活性变化趋势在体内和体外并不一致,呈现出较大差异性。结论:ID1启动子活性随长度变化而表现不同,说明启动子上存在许多顺式调控元件,且体内、外ID1活性变化可能受多种因素的影响,提示不同细胞中的调控机制有所不同。

家蚕Bmlark基因启动子活性及转录调控元件分析

LARK蛋白是一个参与多个发育途径的重要调控转录因子。为研究家蚕Bmlark基因启动子活性及其调控蛋白,本研究克隆了家蚕Bmlark基因的启动子序列(-1232~+211),构建了该启动子萤光素酶报告质粒,转染至家蚕Bm12细胞中,进行启动子萤光素酶活性检测。结果表明,Bmlark基因的-124~-92 bp和-220~-124 bp区域参与了其转录调控。利用-124~-92 bp区域的DNA片段作为分子探针,发现该区域可能与蛋白TAF7,Ets transcription factor,protein abrupt isoform X1和forkhead box protein N3等结合。研究结果为进一步深入研究Bmlark转录调控的分子机制提供了线索。

CD31启动子表达载体的构建与功能鉴定

目的:构建CD31启动子的绿色荧光蛋白和萤光素酶真核表达载体,转染至内皮细胞系HUVEC和BEND3细胞中,对其生物学功能和活性进行初步检测,作为鉴定内皮细胞的新方法。方法:从基因组中钓取CD31启动子的核酸序列,将其插入pGL4.0萤光素酶载体和慢病毒表达载体pCDH-copGFP,经限制性内切酶酶切和测序验证后瞬时转染HUVEC和BEND3内皮细胞系及对照MCF7乳腺癌细胞,通过双萤光素酶实验检测其启动子活性,荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果:双酶切与测序结果表明表达载体中正确插入了CD31启动子序列;双萤光素酶实验和荧光显微镜检测发现CD31启动子特异性在内皮细胞中表达。结论:CD31启动子的萤光素酶和绿色荧光表达载体构建成功,可作为鉴定内皮细胞的新型技术手段。

小鼠Trim30α人同源基因的生物信息学筛选及初步鉴定

目的 通过生物信息学方法寻找Trim30α的人同源基因,观察候选Trim蛋白对TAB2诱导的NF-κB荧光素酶报告基因活性的影响.方法 经MEGA4软件对具有RBCC和SPRY结构域的Trim分子行进化树分析,用DNAMAN 6.0软件对候选Trim与Trim30α进行氨基酸序列比对,比较Trim30α相毗邻基因在小鼠和人染色体上的排列分布规律.构建Trim22的真核表达载体,用双萤光素酶报告基因系统检测Trim22对TAB2诱导的NF- κB报告基因活化的影响.结果 Trim30α与人Trim5α.、Trim6、Trim22、Trim34α来自进化树的同一分支节点；Trim22、Trim5α与Trim30α的氨基酸序列同源性分别为42.51％、45.47％；Trim22可以抑制TAB2诱导的NF-κB报告基因的活化,而Trim5α无显著抑制作用.结论 Trim22对TAB2诱导的NF-κB报告基因活化有负向调节作用,可能与Trim30α具有相类似的生物学功能.

AngⅡ通过AP-1调控内皮细胞中巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的表达

目的明确介导AngⅡ调控人内皮细胞中巨噬细胞移动抑制因子(migration inhibitory factor,MIF)表达的转录因子。方法构建长度依次递减的MIF基因5’调控区的荧光报告基因表达载体,并将其转化入人脐静脉内皮细胞EAhy926。利用双荧光基因报告系统检测AngⅡ诱导后MIF基因5’调控区不同区段的转录活性。通过突变转录活性高的MIF5’调控区序列,初步确定可能的转录因子结合序列。设计针对可能的转录因子的小干扰RNA(siRNA)序列,并构建其表达载体,分别检测候选转录因子沉默的HEAY926中MIF的转录活性和表达水平。结果双荧光基因报告检测显示,AngⅡ调控MIF表达的高转录活性区段位于-507至-188之间。序列突变和荧光素酶活性分析显示,MIF基因5’调控区-350至-339间的AP-1结合序列决定了MIF基因的转录活性。AP-1沉默后的HEAY926中AngⅡ调控的MIF转录活性显著降低(P<0.05),MIFmRNA和蛋白的表达水平也显著降低(P<0.05)。结论AngⅡ通过转录因子AP-1调控内皮细胞中MIF的表达。