利用双萤光素酶报告基因系统筛选有效的siRNA

目的建立一种利用双萤光素酶报告基因系统筛选能有效抑制目的基因表达的小干扰RNA(siRNA)的方法。方法以绿色荧光蛋白(GFP)基因为研究对象,构建3个候选的靶向GFP的siRNA表达质粒pSi-GFPsiRNA1、pSi-GFPsiRNA2、pSi-GFPsiRNA3和阴性对照pSi-Negative。构建拥有同一Kozak共有翻译启始序列、翻译启始密码子ATG的GFP与萤光素酶基因(LUC)的融合表达载体pGL3-GFPf。将包含3个GFPsiRNA靶序列的GFP片段插入到改建过的pGL3-promoter载体上LUC的3'非翻译区(UTR),构建pGL3-GFPp。将GFPsiRNA表达质粒联同内参照质粒pRL-TK分别与pGL3-GFPf、pGL3-GFPp共转化HEK293细胞。利用双萤光素酶检测试剂盒测定各组细胞中萤光素酶的活力水平,用荧光定量PCR检测各组细胞中GFPmRNA的表达水平。结果同对照组相比,与pGL3-GFPf共转化GFPsiRNA表达质粒的各组细胞中萤火虫萤光素酶/海肾萤光素酶比值明显降低,其中GFPsiRNA1表达组中降低最显著(P<0.01);定量PCR检测也显示,GFPsiRNA1表达组中GFPmRNA的表达水平降低最明显(P<0.01)。双萤光素酶活性检测和定量PCR结果还显示,与pGL3-GFPp共转化GFPsiRNA表达质粒的各组细胞中,GFPsiRNA1抑制GFP的表达最显著(P<0.01)。结论本文建立了通过双萤光素酶活性检测来筛选有效的siRNA的方法,并为进行多个基因的有效siRNA的筛选提供解决方案。

用于鉴定microRNA靶基因的新型双萤光素酶报告基因系统的构建及应用

目的:构建用于鉴定microRNA靶基因的报告基因系统。方法:在pGL3-Basic载体的luc基因上游插入CMV启动子,下游插入用于克隆靶基因3'UTR的多克隆位点,构建报告基因载体pMIR-luciferase;将pMIR-lu-ciferase载体的luc基因替换成Rluc基因,构建内参载体pMIR-control;将补体因子H(CFH)的3'UTR插入pMIR-luciferase载体的多克隆位点处,构建含有CFH 3'UTR的报告基因载体;用pIRES2-EGFP载体构建microRNA146a真核表达载体;将含有CFH 3'UTR的报告基因载体、microRNA146a真核表达载体及内参载体共转染HepG2细胞,进行报告基因的活性检测。结果:构建了报告基因载体、内参载体和microRNA146a真核表达载体,经酶切和测序鉴定正确;microRNA146a真核表达载体转染细胞72 h后,经荧光显微镜观察确认载体转染及表达;用实时定量PCR检测,microRNA146a的表达水平显著上调(P<0.01);用构建的报告基因系统检测,结果表明microRNA146a显著地抑制了含CFH 3'UTR的报告基因的活性(P<0.05)。结论:构建了一种新型的报告基因载体系统,该系统可用于miRNA靶基因的鉴定。

双荧光素酶报告基因系统验证hsa-miR-1291对ARHGAP29基因的调控作用

目的验证hsa-miR-1291对ARHGAP29基因的靶向调控作用。方法利用PCR方法,根据目的基因ARHGAP29的3′非编码区(3′untranslated region,3′UTR)序列信息设计扩增引物,以293T细胞基因组DNA为模板,扩增ARHGAP29基因的野生型3′UTR片段(ARHGAP 29-WT 3′UTR)及突变型3′UTR片段(ARHGAP29-MUT 3′UTR),并将其分别克隆到双荧光素酶报告pmiR-RB-Report载体中,构建双荧光素酶基因报告载体,即野生型载体ARHGAP29-WT 3′UTR pmiR-RB-Report和突变型载体ARHGAP29-MUT 3′UTR pmiR-RB-Report。将hsa-miR-1291 mimic、阴性对照(non-target control,NC组)同野生型载体、突变型载体载体分别共转染于293T细胞中,进一步检测相对荧光值。结果成功构建ARHGAP29-WT 3′UTR pmiR-RB-Report载体(野生型载体)、ARHGAP29-MUT 3′UTR pmiR-RB-Report载体(突变型载体)。荧光检测结果显示,野生型载体转染hsa-miR-1291 mimic后,其荧光表达较NC组明显下降(0.67±0.04 vs 1.00±0.08,P=0.014);转染hsa-miR-1291 mimic后,突变型载体的荧光表达相对于野生型载体的荧光表达有所上升(1.20±0.05 vs 0.67±0.04,P<0.001)。结论初步证实hsa-miR-1291很可能对ARHGAP 293′UTR上的该位点有靶向调控作用。

基于荧光素酶双报告基因系统体外验证长爪沙鼠Cip4基因受RXR及T4调控

目的 探讨核转录因子TRB、RXR和激动剂T4对长爪沙鼠Cip4基因表达的调控作用。方法 合成长爪沙鼠Cip4基因启动子区序列,构建报告载体p GL3-Cip4;将转录因子TRB、RXR克隆到pc DNA3. 1表达载体上。将p GL3-Cip4,pc DNA3. 1-TRB,pc DNA3. 1-RXR和pRL-TK(参照质粒)载体共转染到HEK-293细胞,构建Cip4基因的荧光素酶双报告系统。观察质粒用量、TRB的激动剂甲状腺素T4等处理对转录活性的影响。结果 以长爪沙鼠Cip4启动子区为启动序列的双荧光素酶报告基因系统在(启动子+转录因子):pRL-TK=20∶1、总质粒量为2μg时转染效率最高,并具有最高的荧光素酶活性。检测结果显示,仅加入TRB不改变Cip4的转录水平(P>0. 05),仅加入RXR可以增加Cip4的转录水平(P<0. 05),RXR与T4共同作用可上调Cip4的转录水平(P<0. 001)。TRB与T4共同作用可下调Cip4活性(P<0. 05)。RXR、TRB、T4共存时,Cip4的转录水平显著下调(P<0. 01)。结论本研究证实了T4、TRB及RXR共调控长爪沙鼠Cip4基因的转录,模拟了配体激活型转录因子TRB/RXR活化目的基因Cip4的转录,同时证实了Cip4的转录活化与RXR信号通路密切相关,为揭示甲状腺素在人类NAFLD中的作用机制奠定了基础。本报告基因系统可用于配体激活型转录因子调控Cip4基因表达的机理分析及相关药物的筛选。

双荧光素酶报告基因系统在家蚕基因启动子研究中的应用

双荧光素酶报告基因系统是以萤火虫荧光素酶作为主报告基因、海肾荧光素酶作为内参对照的检测系统。它在不同物种的基因启动子转录活性的研究中发挥着重要的作用。目前,在家蚕中已经应用双荧光素酶报告基因系统研究了家蚕生长发育期间基因表达的变化以及病毒侵入家蚕细胞基因表达调控的分子机制等。文章对双荧光酶报告基因系统的发展历史、工作原理及其在家蚕基因启动子转录活性调控研究中的应用和其中存在的问题进行了论述,以期为今后相关研究工作的开展提供参考。

Trim5α对TAB2诱导的NFκB启动子荧光素酶报告基因活性的影响

目的构建人Trim5α的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Trim5α,观察其对TAB2诱导的NFκB启动子荧光素酶报告基因活性的影响。方法提取Hela细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增出Trim5α基因编码区全长片段,克隆到5`-Flag-pcDNA3.1(+),经酶切、菌落PCR及测序进行鉴定。转染HEK293T细胞,Western blot检测Trim5α蛋白的表达,双萤光素酶报告基因系统检测Trim5α对TAB2诱导的NFκB报告基因活化的影响。结果经鉴定,成功构建Trim5α表达载体,该载体可在HEK293T细胞中表达Trim5α,Trim5α对TAB2诱导的NFκB报告基因活化无显著影响。结论 Trim5α对TAB2诱导的NFκB报告基因活化未见显著影响,初步建立了Trim蛋白对NFκB报告基因影响的功能筛选平台。

低密度脂蛋白受体/报告基因系统建立及中药降脂药物的筛选

为了从中药中筛选降脂药物,本文构建了低密度脂蛋白受体/荧光素酶(LDLR/Luc)报告基因系统。将LDLR/Luc报告质粒转染至HepG2细胞,并优化细胞接种密度、细胞培养时间以及检测底物浓度等条件,获得较高荧光素酶活性;进一步选择普伐他汀作为阳性对照药物,可明显提高LDLR/Luc转录活性,表明成功地建立了靶向ldlr转录活性的报告基因筛选体系。应用该体系对500余种中药提取物进行了筛选,决明子、泽泻、穿龙薯蓣等提取物显示阳性,与过去报道采用动物模型研究的结果一致。

含人雌激素受体β基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及脂氧素对其转录活性的调节

目的:构建含人雌激素受体β(ERβ)基因启动子的荧光素酶报告基因载体,并探究阿司匹林诱生的脂氧素(LXA_4)对其转录活性的影响。方法:以子宫内膜间质细胞基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增ERβ启动子序列,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,构建pGL3-basic-ERβ报告基因载体,行双酶切及测序鉴定后将上述载体与pCMX-βgal载体共转染293T细胞24小时后,加入不同浓度(0.1、1、10、100 nmol/L)的LXA_4刺激24小时,然后裂解细胞检测荧光素酶的活性。结果:测序结果表明,构建的pGL3-basic-ERβ荧光素酶报告基因载体序列正确;在293T细胞中,构建的pGL3-basic-ERβ报告基因载体与空载体pGL3-basic相比,pGL3-basic-ERβ报告基因载体的转录活性提高了将近十倍;荧光素酶报告系统表明,LXA4浓度为0.1、1、10、100 nmol/L时其相对荧光强度与对照组比较明显升高(P<0.05),10 nmol/L浓度的相对荧光强度明显高于其他浓度(P<0.05)。结论:成功构建了pGL3-basic-ERβ荧光素酶报告基因载体,并证明在一定浓度LXA_4的刺激下ERβ启动子区域转录活性升高,LXA_4浓度为10 nmol/L时转录活性达最高值。

T细胞活力响应性启动子(TARP)萤光素酶报告系统在CAR⁃T细胞功能鉴定中的应用

目的将T细胞活力响应性启动子(TARP)纳米萤光素酶报告基因系统导入含有嵌合抗原受体(CAR)编码基因的慢病毒质粒中,为CAR⁃T细胞活化水平及功能鉴定提供一种便捷的、定量分析的方案。方法采用全基因合成及分子克隆技术构建重组质粒。慢病毒包装并感染人原代T淋巴细胞,流式细胞术检测慢病毒感染T细胞的阳性率。通过萤光素酶报告基因系统、Western blot法、流式细胞术、小动物活体成像技术鉴定CAR⁃T细胞的功能。结果酶切鉴定和质粒测序结果表明重组质粒的顺利构建,流式细胞术结果显示CAR⁃T细胞的正常制备,萤光素酶活力检测结果表明本系统能够动态响应CAR⁃T细胞的激活,体外功能实验证实本系统能够反映CAR⁃T细胞的耗竭状态,小动物活体成像结果体现了本系统在小鼠体内的示踪功能。结论TARP纳米萤光素酶报告基因系统为评估CAR⁃T细胞活化水平,耗竭状态以及体内示踪等方面提供了更加便捷、灵敏、定量分析的技术手段。

一个新的重组酶系统在转基因植物外源基因删除中的应用

为了解决转基因植物可能带来的生物安全性问题,设计了一个新的位点特异性重组酶系统pLFHFGN,该系统中重组酶FLP基因由热激蛋白Hsp18.2基因的启动子控制,所有外源基因(包括重组酶基因FLP、GUS报告基因和NPTII筛选标记基因)都置于两个融合识别位点loxFRT之间.将上述重组酶系统通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化烟草,获得的再生植株分别通过GUS组织染色和PCR分析等方法进行鉴定.然后在37℃下热激处理转基因植株,利用GUS组织染色检测重组酶系统在转基因植株T1代幼苗中删除外源基因的效率,结果显示,该系统删除效率达到了48.2%～84.9%,说明通过重组酶系统pLFHFGN能够有效地删除转基因植物中的外源基因,这为解决转基因植物潜在的安全性问题提供了一条新的途径.

超声微泡促进肿瘤细胞报告基因转染

目的 探讨超声破坏微泡造影剂后对β-半乳糖苷酶报告基因在人肝癌细胞(QGY)中转染的影响。方法 将培养QGY细胞转于2 4孔培养板后,分为5组,分别为单纯加入质粒组(D) ;质粒+微泡组(D +M) ;质粒+超声组(D +U) ;质粒+超声+微泡组(D +U +M) ;脂质体+质粒组(L +D) ;进行β-半乳糖苷酶质粒DNA的转染。2d后,进行β-半乳糖苷酶染色,测定各组细胞转染率。结果 单纯质粒组细胞转染率为4.92 % ;质粒+微泡组转染率为6 742 % ;质粒+超声组转染率为2 9.73 % ;质粒+超声+微泡组转染率为5 0 .88% ;脂质体+质粒组转染率为12 .15 % ;结论 超声破坏微泡造影剂可促进报告基因β-半乳糖苷酶质粒在QGY细胞的转染,为肿瘤基因治疗提供一种新型基因转移系统。

DNMT3B mRNA3′非编码区报告基因载体的构建与功能验证

目的构建用于鉴定microRNA(miRNA)靶基因的报告基因系统并进行功能验证,为研究动脉粥样硬化的发生发展机制奠定良好基础。方法在pGL3-control载体的荧光素酶基因下游克隆位点插入DNA甲基转移酶3B(DNMT3B)3′非编码区序列,经酶切、测序验证是否插入及正确性。生物信息学分析DNMT3B与miRNA-125b的靶向关系,并用miRNA-125b过表达载体与所构建载体共转染人血管平滑肌细胞,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。结果成功构建了DNMT3B3′非编码区报告基因载体,经酶切和测序鉴定正确;共转染细胞24h后,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性,结果显示与空载体对照组相比,构建载体组荧光素酶活性下降了54.8%(P<0.01)。结论成功构建了DNMT3BmRNA 3′非编码区报告基因载体,且提示miRNA-125b靶向调控了DNMT3B。

丙型肝炎病毒核心蛋白对胞外基质金属蛋白酶诱导物基因转录的影响

目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白对胞外基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN)基因转录的影响。方法:构建HCV核心蛋白真核表达载体和EMMPRIN启动子删除突变体pGL3载体,应用双萤光素酶报告基因系统检测EMMPRIN启动子不同删除突变体的转录活性,并寻找核心蛋白上调EMMPRIN转录相关的关键启动子区段。结果:HCV核心蛋白可以显著上调EMMPRIN的表达;调节EMMPRIN转录的启动子关键区段为+1～435bp,HCV核心蛋白主要通过该关键区段上调EMMPRIN的转录,并呈现剂量依赖性。结论:HCV核心蛋白有可能通过EMMPRIN启动子关键区段上调EMMPRIN的转录,从而上调基质金属蛋白酶,最终导致肝癌转移。

基于荧光素酶活体成像筛选转基因玉米植株的条件优化

通过比较活体成像系统中不同玉米芽长、曝光时间及合并像素值的荧光素酶信号强弱,优化利用活体成像系统筛选转荧光素酶玉米植株的条件。结果表明,在玉米芽长3~8 cm、喷施底物反应2 min后曝光时间5 min、像素合并值binning 8×8的条件下,能够较好地检测到植株荧光素酶信号;进一步对获得的转基因玉米植株进行活体检测,确定了信噪比值大于2.0的植株为强表达阳性植株。研究结果可为转基因植株的后代筛选提供新方法,可以淘汰大量非转基因和表达较弱的植株或株系,有效提高筛选效率。

PDPK13′UTR双荧光素酶报告载体的构建及与gga-miR-148a-5p的靶向验证

本试验通过构建PDPK1基因3′UTR双荧光素酶报告载体,并验证gga-miR-148a-5p与PDPK1的靶向关系。利用生物信息学软件预测gga-miR-148a-5p与PDPK1结合位点;利用PCR扩增PDPK1基因3′UTR序列,将其克隆到PGL3-CMV-LUC-MCS双荧光素酶报告基因载体中;将gga-miR-148a-5p及阴性对照分别与野生型gga-PDPK1-WT-3′UTR双荧光素酶报告质粒共转染至293T细胞中,双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。Targetscan、miRbase数据库预测结果显示,gga-miR-148a-5p与PDPK1基因3′UTR存在互补结合位点;酶切及测序结果表明,双荧光素酶报告载体构建成功;荧光素酶活性试验结果表明,gga-miR-148a-5p mimics能够与PDPK1基因3′UTR结合并抑制荧光素酶活性。gga-miR-148a-5p能够与PDPK1靶向性结合,PDPK1是gga-miR-148a-5p的靶基因。

一种适于家蚕细胞激素研究的双荧光素酶报告基因系统的内参质粒的构建(英文)

双荧光素酶报告基因系统能够提供灵敏的读数,但该系统需要依赖组成型表达的内参对读数进行归一化。然而,大多数内参并不是在所有条件下都组成型表达。为此,文中建立了一个有效的方法制备适于家蚕细胞双荧光素酶报告基因系统的内参质粒。首先,突变BmV gP78启动子上的激素应答相关元件,获得了在家蚕细胞中稳定表达的组成型启动子BmV gP78M;然后,用BmV gP78M替换pRL-SV40质粒上的SV40启动子和嵌合内含子序列,成功构建了pRL-V gP78M内参质粒;最后,通过细胞转染实验证实pRL-V gP78M内参在家蚕细胞系中稳定表达,并且pRL-V gP78M内参的表达活性不受蜕皮激素、保幼激素及激素相关转录因子的影响。最终,获得了在家蚕细胞中稳定表达且表达量适中的内参质粒pRL-V gP78M。该内参可以有效地作为双荧光素酶报告基因系统的内参质粒用于家蚕细胞系中激素的研究。同时,该内参质粒的构建方法也为构建适于其他物种细胞系的双荧光素酶报告基因系统的内参质粒提供了参考。

NF-κB荧光素酶报告基因系统的构建及验证

为了定量检测NF-κB的活化效果及筛选与NF-κB活化调控相关的药物,通过去除逆转录病毒载体pQCXIP原有的CMV启动子,并分别插入NF-κB增强子序列及荧光素酶NanoLuc报告基因序列,构建了一种新的含有NF-κB增强子序列和NanoLuc(NLuc)报告基因序列的表达载体,并进一步建立受NF-κB调控的稳定表达NLuc荧光素酶的细胞系。酶切鉴定及测序结果表明成功构建了重组质粒pQCXIP-NF-κB-NLuc;NF-κB信号通路的刺激物肿瘤坏死因子TNF-α作用于构建的稳定表达NLuc的细胞系后出现特异性的荧光素酶反应,且该酶反应与TNF-α的刺激呈良好的时间、剂量依赖性,该结果表明受NF-κB调控的稳定表达NLuc荧光素酶的细胞系构建成功。实例验证中,NF-κB抑制剂雷公藤甲素对此细胞系NLuc荧光素酶表达的抑制呈剂量效应。综上,本实验构建的受NF-κB调控的稳定表达NLuc荧光素酶的报告基因系统可用于NF-κB的活化效果的定量检测及筛选与NF-κB活化调控相关的药物,具有研究和应用价值。

萤火虫和海肾萤光酶在植物分子生物学中的应用

在植物分子生物学中,编码生物发光蛋白的基因作为报告基因广泛用于检测基因表达.萤火虫萤光酶和海肾萤光酶都具有定量分析方法上的优势,基于此人们开发了双萤光酶报告基因体系.本文就萤火虫和海肾萤光酶的特点及其在植物分子生物学中的应用作一概述.

肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚.为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58).其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性.最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1(由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体)分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达.研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要.

转录因子Sp1和Sp3对食管癌细胞ezrin基因的表达调控作用

目的:明确转录因子Sp1和Sp3对食管癌细胞ezrin基因的表达调控作用。方法:将转录因子表达载体CMV-Sp1和CMV-Sp3分别转染食管癌EC109细胞,采用定量RT-PCR和Western blot技术检测过表达转录因子Sp1和Sp3对ezrinmR-NA和蛋白表达的影响;将ezrin基因启动子驱动的报告基因表达载体与内参照质粒pRL-TK和转录因子表达载体共转染EC109细胞,采用双荧光素酶报告基因分析系统检测转录因子Sp1和Sp3对ezrin基因启动子的激活作用以及这种激活作用是否依赖于ezrin基因的Sp1结合位点-75/-69。结果:过表达转录因子Sp1和Sp3显著提高EC109细胞ezrinmRNA和蛋白表达水平以及启动子活性。Sp1和Sp3增强ezrin基因启动子活性的作用位点不同,只有Sp1通过-75/-69位点调控ezrin基因启动子活性。结论:转录因子Sp1和Sp3可调控EC109细胞ezrin基因的表达。