我国登革2/4型病毒株Pr-M-E基因的双表达质粒构建及在真核细胞中的共表达

将我国登革 2、4型病毒分离株PrM E基因通过RT PCR以病毒RNA为模板扩增我国登革 2型 4 3株和 4型B5株的PrM E基因 .并分别克隆至pGEM TEasy载体 ,然后亚克隆至双顺反子表达质粒的两个多克隆位点 ,获得同时含有登革 2型 4 3株和 4型B5株PrM E基因的双顺反子重组表达质粒pIDME2 4 .在用该重组质粒转染的BHK2 1细胞中 ,不但可检测到PrM E基因的转录产物 ,而且采用间接免疫荧光法还可观察到针对登革 2型 4型病毒的特异荧光 .研究结果表明 ,重组的双顺反子表达质粒在真核细胞中可共表达登革两个血清型PrM E基因 。

原核真核双表达加强型绿色荧光蛋白质粒的构建

将原核启动子 Ptrc和加强型绿色荧光蛋白 ( EGFP)基因从 EGFP原核表达质粒 p YA3 3 3 4-EGFP上切下 ,然后将其插入至真核表达质粒 p VAX1真核启动子 Pcmv的下游 ,构建成具有真核和原核启动子的双表达杂合质粒 p VAXD-EGFP,其长度为 3 82 3 bp。将 p VAXD-EGFP分别转化鼠伤寒沙门氏菌 X45 5 0和转染 COS-7细胞 ,应用流式细胞术、可见光谱扫描、SDS-PAGE测定 EGFP原核表达 ;应用荧光显微镜观察 EGFP在 COS-7细胞内的表达。重组鼠伤寒沙门氏菌 X45 5 0 ( p VAXD-EGFP)表达 EGFP的量与仅以原核方式表达 EGFP的 X45 5 0 ( p YA3 3 3 4-EGFP)相当 ;将质粒p VAXD-EGFP转染 COS-7细胞 ,EGFP可在 COS-7细胞核和胞浆表达 ,在荧光显微镜下发出强烈荧光。结果表明 :不仅成功地构建原核、真核表达集中于同一质粒的新型质粒 p VAXD-EGFP,而且原核、真核目的蛋白表达量达到很高水平 。

双顺反子表达质粒在DNA疫苗研究中的应用

简述了DNA疫苗的研究概况,介绍了真核双表达质粒的结构特点及其在基因佐剂和二价DNA疫苗中的应用情况,总结分析了双表达质粒的优点和存在的问题,并对其今后在DNA疫苗中的研究方向和前景进行了展望。

结核分枝杆菌Ag85B-Ag85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达

目的 :构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体 .方法 :采用 geneSOE ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser) 3 行PCR扩增融合 ,经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3.1 (+)中构建真核表达质粒 pCDAg85B A ,酶切、DNA测序鉴定 ,用脂质体法将 pCDAg85B A转染COS 7细胞 ,采用RT PCR ,ELISA方法检测其表达 .结果 :Ag85B Ag85A融合基因定向克隆入pcDNA3.1 (+) ,双向测序表明碱基无突变 ,Ag85B Ag85A融合基因在真核细胞中能表达 .结论 :成功构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体 。

HLA-C和HLA-G基因真核细胞双表达载体的克隆及鉴定分析

目的 构建人HLA C和HLA G基因真核细胞双表达载体。方法 用RT PCR从孕妇蜕膜组织有核细胞总mRNA中逆转录扩增全长HLA C和HLA GcDNA ,首先将HLA G经BamHⅠ和ClaⅠ双酶切 ,HLA C经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后 ,分别定向插入真核细胞双顺反子载体pVITRO2的多克隆位点 1(mcs1)和 2 (mcs2 )中 ,然后经酶切和测序鉴定 ,确定已建立pVITRO2的单表达质粒pVITRO2 HLA G和pVITRO2 HLA C ,再将HLA CcDNA经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切 ,定向插入单表达质粒pVITRO2 HLA G的多克隆位点 2 (mcs2 )中 ,经PCR反应初筛 ,再经双酶切鉴定。结果 限制性内切酶和测序分析表明已成功构建了HLA Cw 0 10 3和HLA G 0 10 1的单表达质粒pVITRO2 HLA C和pVITRO2 HLA G以及双表达质粒pVITRO2 HLA CG。结论 本研究成功构建了真核细胞双顺反子载体pVITRO2的双表达质粒pVITRO2 HLA CG ,以及单表达质粒pVITRO2 HLA C和pVITRO2 HLA G。

IL-2与猪瘟病毒E_2基因真核双表达载体的构建及其免疫增强作用的研究

应用DNA重组技术构建了猪瘟病毒E2 基因与IL 2基因的双表达真核表达载体 ,观察其表达水平 ,并对其免疫增强效果进行了观察。结果是构建了猪瘟病毒E2 基因与白细胞介素 2的真核表达质粒pIRSTIL 2。将质粒转染BHK 2 1细胞 ,可在体外表达E2 和有生物活性IL 2。pIRSTIL 2质粒能诱导产生CSFV的特异性免疫反应。pIRSTIL 2所诱导的免疫应答反应比使用单表达质粒pIRST强。实验表明 :IL 2与猪瘟病毒E2

双诱导模式原核表达系统的建立与应用

将hG－CSFCDNA片段克隆于T7噬菌体RNA聚合酶启动子系统的表达载体pJGW1中，并与可热诱导T7RNA聚合酶产生的质粒pGP1－2共同转化大肠杆菌DHSα。经化学诱导或温度诱导，hG－CSF重组蛋白表达率＞30％，并具有特异的生物活性。所构建的重组表达工程菌具有良好的稳定性。

BAG-1、Bcl-2双靶区反义RNA重组载体诱导SGC-7901细胞凋亡

目的构建BAG-1、Bcl-2双靶区反义RNA重组载体并初步探讨其对SGC-7901细胞增殖活性的影响。方法从SGC-7901细胞总RNA中逆转录扩增包括全部编码序列的BAG-1和Bcl-2 cDNA,利用生物工程技术,反向插入真核细胞双表达载体pVITRO2的多克隆位点中,转染SGC-7901细胞,MTT法检测对细胞增殖的影响,RT-PCR法观察对细胞BAG-1和Bcl-2 mRNA表达水平的变化,流式细胞术检测对细胞周期的影响。结果限制性内切酶和测序分析表明,双表达质粒pVITRO2-AsBAG-1-Bcl-2构建成功。MTT法检测显示pVITRO2-AsBAG-1-Bcl-2载体抑制SGC-7901细胞增殖,并呈时间依赖性,其中以72 h转染组抑制作用最显著(P<0.01);与对照组比较,pVITRO2-AsBAG-1-Bcl-2组BAG-1和Bcl-2mRNA表达水平下降(P<0.05),细胞凋亡比例升高(P<0.01)。结论成功构建反义双靶区重组载体pVITRO2-AsBAG-1-Bcl-2,并发现其能抑制SGC-7901细胞增殖并引起细胞凋亡。

DJ-1促进α-synuclein正常折叠的研究

α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)在体内异常折叠和纤维化是帕金森病(Parkinson′s disease,PD)发生发展的重要原因.DJ-1蛋白作为分子伴侣可以促进α-Syn的正常折叠,在PD中发挥着重要作用.利用大肠杆菌研究DJ-1的表达对-αSyn(A53T,S129A)折叠的影响.结果表明,野生型DJ-1(WT)使α-Syn(A53T)和α-Syn(S129A)正常折叠分别提高了48%和16%;而突变的DJ-1(M26I,R98Q)丧失了促进α-Syn(A53T)和α-Syn(S129A)正常折叠的功能.