利用CRISPR/Cas9双质粒系统构建Nissle 1917ΔcheZ基因缺失株

为研究趋化性基因cheZ对大肠杆菌益生菌Nissle1917的影响,研究以敲除大肠杆菌Nissle1917的cheZ基因为目的.首先,利用诺唯赞ClonExpress®MultiS一步克隆试剂盒构建pTargetTΔcheZ重组质粒,随后将pTargetTΔcheZ重组质粒电转入含pCas质粒的Nissle1917感受态中,以实现对大肠杆菌益生菌Nissle1917染色体中cheZ基因进行靶向敲除,经PCR鉴定和基因测序双重证实,Nissle1917基因组中的cheZ基因已敲除.最后,经IPTG诱导和高温培养,消除缺失株中的pTargetTΔcheZ和pCas2个质粒,最终获得趋化性基因cheZ缺失株Nissle1917ΔcheZ.本试验为验证cheZ基因在益生菌Nissle1917中的生物活性及其扮演的基因功能的后续相关研究打下了前期基础.

大肠杆菌双质粒CRISPR-Cas9系统的优化及应用

近年来,CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)基因编辑系统已经成功应用于多种微生物中。由于CRISPR-Cas9系统仅受PAM(protospacer adjacent motif)位点NGG的限制,因此理论上CRISPR-Cas9系统可以编辑基因组中任何含NGG的位点或基因,但研究发现该系统对影响微生物生长及代谢的关键靶基因改造时会出现效率降低,甚至是无法获得突变株的现象。前期已有大量研究报道了降低CRISPR-Cas9系统脱靶效应的策略,但依然未能有效解决编辑效率降低的问题。因此,本研究通过使用不同拷贝数的质粒调节Cas9、gRNA的表达和同源臂浓度使其协同发挥基因编辑功能,建立了更加高效的双质粒CRISPR-Cas9系统。试验结果表明,该系统对大肠杆菌pfkA(6-phosphofructokinase isozyme 1)、pfkB(6-phosphofructokinase isozyme 2)、zwf(glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase)单基因敲除最高效率达到100%;在nagABE基因簇位点通过替换引入甘油激酶基因glpK(glycerol kinase)的效率为10%。相比于单质粒CRISPR-Cas9系统,优化的双质粒系统成功进行了pfkB基因的敲除及glpK基因的整合,且将pfkA、zwf基因的敲除效率分别提升了31%和63%。突变株与野生株之间碳源代谢的差异进一步表明基因敲除效率与基因特殊活性相关。结果证明,过量的靶基因同源臂和gRNA的过表达可以有效提升CRISPR-Cas9系统在大肠杆菌中的编辑效率。

细菌sRNA调控靶标的双质粒筛选系统构建

以pMycVec1/pMycVec2载体为基础,构建了筛选和鉴定细菌sRNA调控靶标的双质粒系统。对pMycVec2载体的多克隆位点进行改造,并加入强启动子rrnBp和有效转录终止子,获得可定向克隆和转录sRNA的质粒pMycVec2-D;对pMycVec1载体的多克隆位点进行改造,并加入弱启动子Pwk和有效转录终止子,获得了分别用报告基因lacZ和GFP来检测sRNA靶标序列翻译水平的质粒pMycVec1-lacZ和pMycVec1-GFP。最后,利用2对已知的sRNA与其调控靶标MicC/ompC mRNA和MicF/ompF mRNA,通过β-半乳糖苷酶活性和菌体荧光值检测,表明双质粒系统能有效检测sRNA与调控靶标的互作。

原核真核双表达加强型绿色荧光蛋白质粒的构建

将原核启动子 Ptrc和加强型绿色荧光蛋白 ( EGFP)基因从 EGFP原核表达质粒 p YA3 3 3 4-EGFP上切下 ,然后将其插入至真核表达质粒 p VAX1真核启动子 Pcmv的下游 ,构建成具有真核和原核启动子的双表达杂合质粒 p VAXD-EGFP,其长度为 3 82 3 bp。将 p VAXD-EGFP分别转化鼠伤寒沙门氏菌 X45 5 0和转染 COS-7细胞 ,应用流式细胞术、可见光谱扫描、SDS-PAGE测定 EGFP原核表达 ;应用荧光显微镜观察 EGFP在 COS-7细胞内的表达。重组鼠伤寒沙门氏菌 X45 5 0 ( p VAXD-EGFP)表达 EGFP的量与仅以原核方式表达 EGFP的 X45 5 0 ( p YA3 3 3 4-EGFP)相当 ;将质粒p VAXD-EGFP转染 COS-7细胞 ,EGFP可在 COS-7细胞核和胞浆表达 ,在荧光显微镜下发出强烈荧光。结果表明 :不仅成功地构建原核、真核表达集中于同一质粒的新型质粒 p VAXD-EGFP,而且原核、真核目的蛋白表达量达到很高水平 。

基于双质粒拯救系统的新城疫病毒LaSota株的拯救

传统新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)的拯救系统包括一个cDNA克隆质粒和分别表达NDV的核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、聚合酶蛋白(L)的3个辅助质粒,且必须满足4个质粒同时转染进入同一个宿主细胞才能完成病毒的组装,效率相对低下。【目的】提高NDV的拯救效率,并建立双质粒高效拯救系统。【方法】将NP、P、L基因表达盒串联克隆至真核表达载体pCI中,构建为可同时表达NP、P、L蛋白的单辅助质粒PCI-NPL;同时,采用分段克隆再拼接的方式,将NDVLaSota株基因组cDNA克隆于真核表达质粒pCI的CMV启动子下游,并分别在P和M基因中插入报告基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)、5′端引入锤头状核酶序列、3′端引入丁型肝炎病毒核酶序列,构成全基因组转录质粒pCI-LaSota-EGFP;以pCI-LaSota-EGFP和pCI-NPL组成病毒拯救系统共转染至BHK-21细胞,拯救获得重组子代病毒rLaSota-EGFP,并进行系列生物学特性鉴定。【结果】经RT-PCR、荧光显微镜观察、Western blotting、生长特性测定等系列鉴定,证明rLaSota-EGFP构建正确,成功拯救获得了重组病毒rLaSota-EGFP,且与野生型(wild-type,WT)LaSota具有相似的生物学特性。【结论】基于CMV启动子的NDV双质粒新型拯救系统构建成功,为重组NDV及其他副黏病毒的高效拯救奠定了基础。

双诱导模式原核表达系统的建立与应用

将hG－CSFCDNA片段克隆于T7噬菌体RNA聚合酶启动子系统的表达载体pJGW1中，并与可热诱导T7RNA聚合酶产生的质粒pGP1－2共同转化大肠杆菌DHSα。经化学诱导或温度诱导，hG－CSF重组蛋白表达率＞30％，并具有特异的生物活性。所构建的重组表达工程菌具有良好的稳定性。

蛋白质N端豆蔻酰化修饰的基因工程表达偶联加工系统

对酵母ＮＭＴ基因在大肠杆菌中表达进行较详细的研究，进而构建了复制子为ｐ１５Ａ并含卡那霉素抗性基因的相容性表达质粒ｐＫＺＭＴ，将其与表达质粒ｐＣＺｍＣα１共转化进大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｆ′，进行双质粒表达偶联加工修饰研究，其中ｐＣＺｍＣα１表达底物蛋白小鼠ｃＡＭＰ依赖的蛋白激酶催化亚基α（ＰＫＡｍＣα）。ＳＤＳＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析表明，双质粒表达系统中，ＰＫＡｍＣα都得到了稳定的高表达，尤其在２３℃低温诱导表达时，表达产物的可溶性部分明显增多；而酵母ＮＭＴ被控制在有利于活性功能的可溶性低水平表达。［３Ｈ］ｍｙｒｉｓｔｉｃａｃｉｄ标记测定及放射自显影的结果显示，在大肠杆菌中表达的重组ＰＫＡｍＣα被豆蔻酰化修饰。

大肠杆菌L-组氨酸生物合成途径的改造及其对工程菌L-组氨酸产量的影响

改造大肠杆菌L–组氨酸生物合成途径,以提高L–组氨酸的产量.用NTG诱变大肠杆菌M-17(SGr),依次赋予其2–噻唑丙氨酸(2-TA)和组氨酸氧肟酸盐(HisHx)遗传标记,再以突变株M-18(SGr+2-TAr+HisHxr)基因组为模板,扩增组氨酸操纵子基因,构建出重组质粒pUC118-his-operon,将重组质粒导入突变株M-18(SGr+2-TAr+HisHxr)得到工程菌E.coli M-19(SGr+2-TAr+HisHxr/pUC118-his-operon).根据zwf和prs基因序列分别合成引物进行PCR扩增,PCR产物与载体pSTV28连接,构建重组质粒pSTV28-zwf、pSTV28-prs和pSTV28-zwf-prs,将重组质粒分别转化至工程菌E.coli M-19,摇瓶发酵测定重组工程菌L–组氨酸的产量.摇瓶发酵结果显示,L–组氨酸产量与对照株相比,工程菌E.coli M-19提高了4.5倍,双质粒系统重组工程菌E.coli MZH-19、E.coli MPH-19和E.coli MZPH-19分别提高了5.14、5.78、8.43倍.