双控表达载体系统的构建及其在基因表达方面的应用（英文）

可严格调控性是体现原核表达载体优越性的重要指标。构建了一种双控双调节原核表达载体系统,用双载体控制调节目的基因的表达,即SP6启动子(promoter)+乳糖(lac)调节基因表达系统和araB启动子(promoter)+ara C调节基因表达系统,分别由乳糖类似物IPTG和阿拉伯糖(L-arabinose)诱导目的基因的表达。该系统由2个表达载体共同完成目的基因的表达。pE SP-1为主表达载体,即目的基因克隆到此表达载体上,由SP6启动子(promoter)+乳糖(lac)调节基因调控;pA RA-SP6为辅助表达载体,该载体通过SP6 RNA聚合酶的表达来控制调节主表达载体的启动子(SP6),由araB启动子(promoter)+ara C调节基因调控。实验结果显示该双控双调节表达载体系统控制严格,并且表达蛋白的量具有可调控性。

基于SSA修复机制和特异性核酸酶活性检测的双荧光报告载体系统的开发及应用

报告载体系统因构建快捷、改造简单、操作容易、经济有效,并且能通过介导筛选核酸酶阳性细胞富集基因组修饰的阳性细胞克隆,而成为特异性核酸酶活性检测的重要手段。基于非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)修复机制的报告系统在引入DNA双链断裂(Double strand breaks,DSBs)后,经过优化最高也只有2/3的概率实现报告基因的修复;而单链退火(Single strand annealing,SSA)修复机制在引入DSBs后,理论上可以实现报告基因100%的修复,具有更高的灵敏度,有利于活性较低的特异性核酸酶活性的检测,为基因组修饰研究中特异性核酸酶活性的检测提供了有效的手段。本研究设计并构建了3套基于SSA修复机制的双荧光报告载体系统,并应用m RFP-e GFP系统检测了3对ZFNs的有效活性,其活性检测结果分别为8.9%、9.3%和5.0%,该研究为核酸酶活性的检测提供了有效的手段。

用杆状病毒双穿梭载体表达系统表达HCV结构基因及HCV病毒样颗粒装配的初步观察

利用长RT PCR技术 ,一次性克隆出HCV的结构基因C、E1、E2及部分 5’UTR ,经测序 ,验证了其正确性。将克隆基因插入杆状病毒双穿梭载体系统的转移载体 ,经转座并转染sf9细胞 ,得到重组病毒Bmhce ,经SDS PAGE和ELISA测定 ,表明HCV结构基因在重组病毒感染的sf9细胞中表达 ;另外 ,电镜观察发现在重组病毒感染的sf9细胞质的空泡 (vesicle)中有HCV样颗粒的存在 ,说明HCV结构基因表达产物在sf9细胞中组装出病毒样颗粒。

超声联合携抗ICAM-1微泡的双靶向载体系统增强基因转染受损内皮细胞

目的:探讨超声联合携抗细胞间黏附分子(ICAM)-1阳离子微泡的双靶向载体系统介导基质细胞衍生因子(SDF)-1α基因转染受损内皮的效果。方法:实验分组,A组:携SDF-1α基因抗ICAM-1阳离子微泡;B组:携SDF-1α阳离子微泡;C组:空白对照。体外实验:人白细胞介素-1β刺激制备大量表达ICAM-1的血管内皮细胞模型,各组联合超声辐照介导基因转染后测定基因转染率、基因和蛋白表达情况。体内实验:结扎冠状动脉前降支制备兔心肌梗死模型,超声辐照介导基因转染后取心肌组织,Western blot检测各组心肌SDF-1蛋白的表达情况,RT-PCR检测各组SDF-1 mRNA的表达情况。结果:无论是体外实验还是体内实验,A组:携SDF-1α基因抗ICAM-1阳离子微泡组超声辐照后的基因转染率、hSDF-1α基因mRNA表达和hSDF-1α蛋白表达情况均高于其他各组。结论:超声联合携抗ICAM-1微泡的双靶向载体系统能增强SDF-1α基因转染受损内皮细胞。

双载体断裂CFTR基因转移及翻译后的连接和功能

囊性纤维化跨膜电导调节体(CFTR)基因突变导致一种常染色体隐性遗传病囊性纤维化(CF),利用腺辅助病毒(AAV)载体转运CFTR基因的基因疗法受到AAV载体容量的限制。本文采用intein的蛋白质反式剪接技术,以双载体转运CFTR基因,研究了于其调节结构域(R)断裂成两部分的CFTR基因翻译后的连接及其产生的Cl-通道功能。将人CFTRcDNA于R结构域的Ser712密码子前断裂,构建一对融合SspDna Bintein编码序列的真核表达载体。将这对载体共转染培养的幼年仓鼠肾(BHK)细胞,通过瞬时表达,全细胞和单通道膜片钳记录Cl-电流,并用Westernblotting观察CFTR蛋白的剪接。结果表明,共转染细胞显示较高的全细胞Cl-电流和单个Cl-通道开放活性,说明CFTR的Cl-通道功能的恢复,用CFTR特异性抗体进行的细胞总蛋白Westernblotting显示有完整的CFTR蛋白条带形成,表明intein可有效连接翻译后的两部分CFTR蛋白。结果提示,蛋白质剪接技术可有效用于双载体系统转运CFTR基因,为进一步应用双AAV载体转运CFTR基因的CF基因治疗研究提供了实验依据。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因对肝癌细胞杀伤作用及旁观者效应研究

目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL)基因在诱导肝癌细胞凋亡时是否存在旁观者效应 ,以及旁观者效应的可能机制。方法 构建表达TRAIL基因的双腺病毒载体系统Ad/GT TRAIL +Ad/PGK GV16 ,通过 2 93包装细胞产生的病毒上清液将TRAIL基因转入肝癌细胞SMMC772 1细胞中 ,RT PCR检测TRAIL基因的表达 ,以MTT法检测细胞生长抑制率 ,流式细胞仪检测细胞凋亡率 ;不同比例混合培养SMMC772 1/TRAIL和SMMC772 1细胞 ,检测混合细胞生长抑制率来评价TRAIL基因的旁观者效应 ,并以滤去细胞成分的转染细胞培养液培养未转染细胞 ,观测可溶性因子在TRAIL基因旁观者效应中的作用。结果 TRAIL基因对SMMC772 1细胞的生长抑制率与PBS、LacZ基因和Bax基因比较 ,差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ;SMMC772 1细胞的凋亡率 ,TRAIL基因与PBS、LacZ基因和Bax基因比较 ,差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ;混合细胞的生长抑制率 ,以SMMC772 1/TRAIL占 0 %时为 0 ,占 5 %时为 15 .9% ,占 2 5 %时为 6 7.0 % ,占 5 0 %时为 80 .2 % ,占 10 0 %时为 87.7% ;以PBS对SMMC772 1的生长抑制率为 0 ,则滤去细胞成分的转染细胞培养液对SMMC772 1的生长抑制率为 4 % ,两者差异无显著性。