脑组织双重免疫荧光标记方法介绍

应用光学技术对荧光标记的组织切片样品进行成像观察是生物学研究的常规手段。本文主要介绍如何制备用于荧光显微镜和激光共聚焦显微镜成像的脑组织石蜡切片免疫荧光双重标记技术。

激光共聚焦显微镜观察免疫荧光双重标记的前列腺癌内基质金属蛋白酶及其作用底物的表达

目的:探讨应用激光共聚焦显微镜观察免疫荧光双重标记的前列腺癌标本的可行性及优点。方法:应用激光扫描共聚焦显微镜同时检测前列腺癌中基质金属蛋白酶(MMPs)和其作用底物的表达情况。结果:在激光扫描共聚焦显微镜下,可以清晰地观察MMP-7和层粘连蛋白(LN)可共同表达于前列腺癌细胞及基质中的基底膜、血管平滑肌和神经纤维;MMP-9和Ⅳ型胶原的主要表达于细胞外基质中的基底膜。结论:结合应用激光扫描共聚焦显微镜和免疫荧光双重标记技术能对蛋白进行精确的定位研究。

多重标记免疫组化技术在消化道肿瘤研究中的应用

目的:探讨消化道肿瘤病理标本切片三重标记免疫组化的方法。方法:采用非同源第一抗体Ki-67、Net-1和CD34,选用辣根过氧化物酶不同底物显色AEC和DAB,运用pH2.2甘氨酸-盐酸缓冲液作阻断剂,配合碱性磷酸酶检测系统作第一标记的方法分步进行免疫组化染色操作。结果:镜下观察在肿瘤组织中,Ki-67定位于细胞核呈蓝黑色, Net-1定位于细胞质呈棕黄色,CD34定位于血管内皮细胞。染色鲜艳,对比鲜明。结论:该法对于运用免疫组化方法研究原位显示3种抗原及其之间的关系具有一定的实用价值。

量子点联合Cy5双重荧光标记人舌鳞状细胞癌细胞蛋白质的应用研究

目的比较以量子点(quantum dots,QDs)与Cy5荧光染料对人舌鳞癌细胞株Tca8113细胞中热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)和survivin蛋白质进行双重免疫荧光标记时蛋白质的分布及荧光的稳定性。方法以QDs和Cy5荧光染料对Tca8113细胞内HSP70和survivin蛋白质进行双重免疫荧光标记,在激光共聚焦显微镜下同时观察Tca8113细胞内的HSP70和survivin蛋白质表达及分布。激光连续照射2 420 391 ms,用激光共聚焦显微镜自带软件Leica Confocal Software测量QDs和Cy5的荧光信号强度变化。结果激光共聚焦显微镜下可见Tca8113细胞内HSP70和survivin蛋白质均有明显表达,分别表现为绿色和红色荧光,其中两种蛋白质重叠处呈黄色荧光。激光连续照射2 420 391 ms,QDs标记的绿色荧光未见明显衰减,而Cy5荧光染料标记的红色荧光基本淬灭,随着Cy5荧光的淬灭,绿红黄三色通道下所见的红绿黄3种颜色的荧光也逐渐消退直至变成单色的绿色荧光。结论 QDs对光漂白的抵抗能力强,比Cy5荧光染料具有更高的光稳定性,更加适用于细胞内蛋白质的长时间动态监测的研究。

免疫荧光双重标记结合激光共聚焦扫描显微镜观察Ⅰ型胶原和硫酸软骨素在人牙本质中的分布

目的 介绍牙本质在不完全脱矿下免疫荧光双标染色方法,研究Ⅰ型胶原和硫酸软骨素在人牙本质中的分布情况,以期进一步理解牙本质湿粘接的机制.方法 选取新鲜拔除的无龋第三磨牙8颗,制备30 μm厚的牙本质切片40张,用37％磷酸凝胶酸蚀15 s,应用免疫荧光双重标记方法和激光共聚焦扫描显微镜,观察硫酸软骨素经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（tosyl-phenylalanyl chloromethyl ketone,TPCK）处理的胰蛋白酶消化去除前后相对胶原纤维的分布位置.结果 硫酸软骨素分布于牙本质小管管腔以及管周牙本质,Ⅰ型胶原纤维在管间牙本质和管周牙本质均存在;经特异性酶处理去除硫酸软骨素后,荧光强度明显减弱甚至消失.结论 免疫荧光双重标记结合激光共聚焦扫描显微镜可以在牙本质不完全脱矿的情况下研究其内部有机成分的分布;硫酸软骨素分布于牙本质小管管腔及管周牙本质,Ⅰ型胶原纤维分布于管间牙本质和管周牙本质.

白细胞介素-2受体和糖皮质激素受体在脑神经元内共存

目的 研究白细胞介素 2受体和糖皮质激素受体在大鼠脑内的分布及两者共存的可能性。 方法 免疫细胞化学双重标记技术 (PAP法与ABC法相结合 ) ,分别采用DAB和DBHC(二盐酸联苯胺 )呈色 ,前者为棕黄色 ,后者为深蓝色。 结果 白细胞介素 2受体和糖皮质激系受体广泛分布于大脑皮质、海马、下丘脑 ,脑干大部分运动性和感觉性核团。白细胞介素 2受体免疫反应产物位于细胞膜上 ;糖皮质激素受体免疫反应产物位于细胞核和胞浆内。脑内有较多的白细胞介素 2受体和糖皮质激素受体共存的神经元 ,它们在阳性神经元总数中所占的比例在不同的脑区有所不同。在大脑皮质约占 5 0 % ,在展神经核约占 30 %。 结论 免疫细胞因子和激素可通过各自的受体作用于同一个脑神经元而调节神经元的功能。本实验在受体水平为“免疫 神经 内分泌调节网络”

AD7c-NTP与胰岛素受体在小鼠海马CA1区的共存关系

目的观察Alzheimer相关的神经丝蛋白(Alzheimer-associated neuronal thread protein,AD7c-NTP)在正常小鼠海马CA1区的分布及其与胰岛素受体的共存关系。方法应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)方法观察小鼠脑蛋白提取物中AD7c-NTP的相对分子质量大小和抗体的特异性。应用免疫组织化学方法观察AD7c-NTP在正常小鼠海马CA1区的分布。应用免疫组织化学双重标记技术观察AD7c-NTP与胰岛素受体的共存关系。结果AD7c-NTP免疫反应阳性条带位于相对分子质量约41 000的位置,与文献报道一致;正常小鼠海马CA1区有AD7c-NTP免疫反应阳性细胞分布,细胞膜和细胞质染色并存在AD7c-NTP和胰岛素受体免疫反应双阳性细胞。结论AD7c-NTP在正常小鼠海马CA1区有分布并与胰岛素受体有共存关系,提示AD7c-NTP的功能可能与胰岛素信号通路有关。

两种粒径量子点在人舌鳞癌细胞中双色荧光成像的应用研究

目的研究粒径655 nm和525 nm的两种量子点(quantum dots,QDs)对人舌癌Tca8113细胞内2种热休克蛋白(heat shock protein,HSP)进行特异性荧光标记的成像效果和稳定性,为今后的连续动态观察提供实验依据。方法利用QD655nm和QD525nm,对人舌癌Tca8113细胞内HSP90蛋白和HSP70蛋白进行特异性双重荧光标记,激光连续照射2 420 391 ms,在共聚焦显微镜下同时观测人舌癌Tca8113细胞内的HSP90蛋白和HSP70蛋白表达及分布,用软件Leica Confocal Software测量量子点QD655nm和QD525nm的荧光信号强度变化。结果激光共聚焦显微镜下可见人舌癌Tca8113细胞内HSP90蛋白和HSP70蛋白均有明显表达,分别表现为红色和绿色荧光,两种蛋白重叠处呈黄色荧光,在激光连续照射中,两种荧光有所衰减,其中QD655nm的荧光强度值下降相对较快、幅度相对较大。结论量子点荧光标记技术能同时对人舌鳞癌细胞中HSP90蛋白和HSP70蛋白进行双重标记,而且QD655nm与QD525nm都具有较强的光稳定性,均可用于蛋白的长时间动态监测,其中QD525nm的稳定性更好。

大鼠延髓孤束核吻侧段内脑啡肽阳性终末与γ-氨基丁酸阳性神经元联系的形态学研究

目的观察大鼠孤束核吻侧段(rNTS)内脑啡肽阳性(ENK-ir)终末与γ-氨基丁酸(GABA-ir)阳性神经元之间的联系。方法免疫荧光双重标记技术,包埋前免疫组织化学方法染色结合免疫金颗粒标记的电镜双标技术。结果激光扫描共焦显微镜下可见rNTS内有大量的ENK-ir纤维和终末及散在的GABA-ir神经元。ENK-ir终末与GABA-ir神经元之间形成密切接触。在电镜下可见ENK-ir阳性产物主要定位于圆形清亮突触小泡及大颗粒囊泡表面。ENK-ir轴突终末与GABA-ir及阴性神经元胞体及树突之间形成对称性和非对称性的突触联系,以对称性突触为主。结论rNTS内的ENK-ir终末可能通过抑制或增强GABA能神经元活性,或直接抑制味觉感受神经元活性的方式,参与NTS内味觉信息的感受和调节。

AD7C-NTP与胰岛素受体在小鼠海马CA1区的共表达研究

目的：观察AD7C-NTP在正常小鼠海马CA1区的分布及其与胰岛素受体的共存关系。方法：应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白印迹（Westernblot）方法观察小鼠脑蛋白提取物中AD7C-NTP的分子量位置和抗体的特异性；应用免疫组织化学和免疫组织化学双重标记技术观察AD7C-NTP在正常小鼠海马CA1区的分布及其与胰岛素受体的共存关系。结果：AD7C—NTP免疫反应阳性条带位于分子量约41KDa的位置，与文献报道一致；正常小鼠海马CA1区有AD7C_NTP免疫反应阳性细胞分布，细胞膜和细胞浆染色，并存在AD7C—NTP和胰岛素受体免疫反应双阳性细胞。

大鼠脑干内的calbindin D-28K可能参与内脏伤害性信息传递或调控的形态学研究

为研究calbindinD 2 8K(CB)是否与内脏伤害性信息的传递或调控有关 ,应用免疫组织化学双重标记技术 ,对给予内脏伤害性刺激后大鼠脑干内表达Fos蛋白的CB免疫阳性神经元分布进行了观察。结果显示 :在孤束核 (NTS)、延髓腹外侧区 (VLM)、蓝斑 (LC)、臂旁外侧核 (LPB)、中脑导水管周围灰质腹外侧区 (vlPAG)等核团内均可见Fos/CB双标记神经元。双标记神经元分别占上述核团内Fos蛋白免疫阳性神经元数量的比例为12 .8% ,4 2 .7% ,4 8.1% ,14 .0 %和 13.9% ;占CB免疫标记阳性神经元数量的比例为 14 .3% ,2 4 .3% ,38.4 % ,6 .8%和 8.9%。研究结果提示 ,CB可能参与脑干内内脏伤害性信息的传递或调控。

糖尿病兔模型视网膜VEGF表达的定位研究

目的研究糖尿病兔动物模型血管内皮细胞生长因子(VEGF)在视网膜中的定位。方法应用四氧嘧啶制备糖尿病兔动物模型,采用免疫荧光、免疫荧光双重标记技术,分别以胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体、VEGF抗体为一抗;羊抗兔IgG-Cy3、马抗鼠IgG-FITC为二抗进行免疫荧光染色。结果在糖尿病兔动物模型视网膜中,GFAP与VEGF共同表达于视网膜Müller细胞。结论糖尿病兔模型中,视网膜Müller细胞通过表达VEGF发挥促进新生血管形成的作用。