家蚕双重氧化酶BmDUOX的序列特征、表达模式及病原诱导表达

【目的】研究双重氧化酶(dual oxidase,DUOX)在家蚕Bombyx mori中的表达模式,探析其在家蚕肠道免疫机制中的作用。【方法】通过氨基酸多重序列比对和系统进化分析对Bm DUOX蛋白氨基酸序列特征进行研究,并采用RT-PCR方法扩增获得家蚕Bm DUOX膜外部分Bm DUOX_OM基因序列。在大肠杆菌Eescherichia coli(DE3)中诱导表达并通过亲和层析法纯化获得重组表达蛋白,以其为抗原免疫昆明鼠,获得对应的多克隆抗体;利用所得的抗体检测Bm DUOX的表达和细胞定位。通过半定量RT-PCR方法分析Bm DUOX在家蚕不同发育时期和组织中的表达模式及病原诱导表达谱。另外,利用活性氧检测试剂盒分析家蚕微孢子虫Nosema bombycis诱导后家蚕Bm E细胞的活性氧(ROS)的含量。【结果】生物信息学分析表明,Bm DUOX内有保守的Peroxidase,Ferric_reduct,EF-hand,FAD-binding和NAD-binding结构域,且具有6个跨膜区,跨膜形式与人类Homo sapiens、果蝇Drosophila melanogaster等的DUOX蛋白的跨膜形式一致。多重序列比对分析表明,Bm DUOX的过氧化酶区域内具有过氧化物酶的保守活性位点。克隆获得家蚕Bm DUOX_OM基因,并纯化获得重组表达蛋白,制备的鼠多抗具有较好的特异性。间接免疫荧光实验(IFA)表明,Bm DUOX位于家蚕Bm E细胞的细胞膜上。表达模式分析表明,Bm DUOX在家蚕5龄第3日幼虫和成虫中表达量较高;且在幼虫表皮、精巢、卵巢和头内高量表达,在成虫的卵巢、精巢、表皮和脂肪体内也有较高的表达量。病原诱导分析表明,通过肠道起始感染的家蚕微孢子虫能够诱导家蚕幼虫中肠Bm DUOX基因持续上调表达,且其诱导后的Bm E细胞内活性氧含量也明显增加,提示Bm DUOX调控的肠上皮ROS应答参与抵抗家蚕微孢子虫的侵染。【结论】Bm DUOX含有典型的结构域及保守的活性位点,表明其在家蚕中具有保守的生物学功能。Bm DUOX在家蚕不同发育时期、不同组织及病原诱导下的表达谱提示其可能参与宿主肠上皮对家蚕微孢子虫的免疫反应。

甜菜夜蛾双重氧化酶基因SeDuox的克隆、表达及功能分析

【目的】昆虫双重氧化酶(dual oxidase,Duox)介导产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)是调节昆虫肠道微生物动态平衡的重要免疫机制。本研究通过分析甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)双重氧化酶基因(SeDuox)的序列特征与表达模式,RNAi技术探究SeDuox基因沉默对甜菜夜蛾肠道细菌载量的影响,分析SeDuox对苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)的免疫响应,从而明确SeDuox在昆虫肠道免疫调控中的作用,为甜菜夜蛾的综合防控提供新的思路和作用靶标。【方法】利用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆SeDuox,序列特征进行生物信息学分析,采用ClustalX和MEGA_X软件构建系统发育树;克隆SeDuox膜外91-1767 bp编码基因SeDuox-OM,利用Bac to Bac表达系统构建Bacmid-SeDuox-OM,脂质体转染法转染昆虫细胞Sf9,表达SeDuox-OM膜外蛋白;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法分析甜菜夜蛾不同组织(围食膜、血淋巴、脂肪体、马氏管、中肠和表皮)和不同发育时期(卵、1-5龄幼虫、雌蛹、雄蛹)SeDuox的表达水平;利用RNAi技术进行功能分析,向4龄幼虫注射SeDuox的dsRNA,以注射绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的dsRNA作为对照,注射48 h和72 h后检测基因沉默效果及肠道细菌载量的变化;向甜菜夜蛾幼虫饲喂Bt,RT-qPCR方法分析SeDuox及相关免疫基因的诱导表达情况。【结果】SeDuox序列全长为4497 bp,编码1498个氨基酸,预测蛋白质的相对分子量为171.62 kD。SMART分析结构域发现SeDuox含有过氧化物酶结构域(peroxidase)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结构域(NAD)、N-端钙离子结合域(EFH)、铁还原酶结构域(Ferric)和黄素腺嘌呤二核苷酸结构域(FAD),与斜纹夜蛾(Spodoptera litura)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)等昆虫的Duox结构域类似。TMHMM分析显示有7个跨膜区,跨膜片段SeDuox-OM在昆虫细胞中成功表达约80 kD的重组蛋白;RT-qPCR分析结果显示SeDuox在甜菜夜蛾4龄幼虫不同组织中均有表达,其中围食膜和中肠表达量较高;在不同发育时期均有表达,但在卵期表达量最高。与注射dsGFP相比,注射dsSeDuox的甜菜夜蛾幼虫在48 h和72 h时,SeDuox表达量分别下调了62.08%和74.94%,肠道微生物载量显著升高。甜菜夜蛾幼虫取食Bt GS3648 h时,SeDuox表达量显著增加,随着侵染时间的延长,其表达量呈现出先升高后降低再趋于稳定的特点。【结论】甜菜夜蛾SeDuox具有保守的结构域,在中肠和围食膜中高表达,SeDuox在宿主肠道免疫调控中起重要作用,可能与抗菌肽基因协同作用抵御Bt的侵染。

棉铃虫双重氧化酶HaDuox的序列特征和表达及病原诱导分析

【目的】探索棉铃虫双重氧化酶在昆虫肠道防御机制中的作用。【方法】克隆棉铃虫HaDuox编码区基因,并利用生物信息学方法分析其编码的氨基酸序列;构建HaDuox膜外1117到1770 bp编码基因的原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达特异性蛋白;采用实时荧光定量PCR技术分析棉铃虫幼虫不同组织和不同发育时期HaDuox基因的转录水平;通过测定基因相对表达量研究棉铃虫HaDuox基因对苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)诱导的免疫响应。【结果】棉铃虫HaDuox基因开放阅读框长4497 bp,编码1498个氨基酸,预测编码蛋白的相对分子量为171.91 kD。HaDuox与家蚕、橘小实蝇、意大利蜜蜂等昆虫的双重氧化酶结构域类似,含有过氧化物酶结构域,钙离子结合域,铁还原结构域,黄素腺嘌呤二核苷酸结合域和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合域。有7个跨膜区,在第29个和第30个氨基酸位点之间存在一个信号肽切割位点。HaDuox膜外片段在大肠杆菌中成功表达约25 kD的重组蛋白。实时荧光定量PCR结果显示HaDuox基因在马氏管和卵期表达量较高。苏云金杆菌侵染棉铃虫幼虫12 h时诱导HaDuox的大量表达,与对照相比,随着侵染时间的延长,其表达量呈现出先升高后降低再趋于稳定的特点。【结论】实现棉铃虫双重氧化酶基因膜外片段的外源表达,并对HaDuox基因序列特征,不同发育时期和组织表达模式,病原诱导表达进行研究,为研究HaDuox在肠道免疫中扮演的角色及棉铃虫响应病原菌侵染的分子机制提供依据。

非甾体抗炎药环氧化酶/5-脂氧化酶双重抑制剂的研究进展

非甾体抗炎药具有解热、镇痛、抗炎和抗风湿等作用。现有的非甾体抗炎药大多存在胃肠道不良反应或心脏病发作和心肌梗死等方面的副作用,而环氧化酶/5-脂氧化酶双重抑制剂不仅具有较强的解热、镇痛、抗炎和抗风湿等作用,而且未发现有心脏病发作、心肌梗死和胃肠道损伤的危险,因此环氧化酶/5-脂氧化酶双重抑制剂已成为研究新一代非甾体抗炎药的途径。

HNE诱导下PKCδ/θ-Duox1-ROS对气道黏液高分泌影响的体外实验研究

目的:探讨蛋白激酶C(PKC)δ/θ-双重功能氧化酶1(Duox1)-活性氧(ROS)信号通路对人气道黏蛋白(MUC)5AC的调控作用及机制,为气道黏液高分泌治疗提供新靶点。方法:PKC及其亚基PKCδ/θ抑制剂、Duox1抑制剂或自由基清除剂DMTU预处理人气道上皮细胞16HBE,给予人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)刺激建立体外气道炎症细胞模型。试剂盒测定各组细胞ROS生成水平,实时荧光定量PCR检测Duox1和MUC5AC mRNA水平,Western blot测定各组细胞干扰因素对Duox1蛋白水平的影响,ELISA和免疫荧光检测各组细胞MUC5AC蛋白表达。结果:与对照组相比,HNE组ROS生成明显增多,Duox1、MUC5AC mRNA和蛋白表达增加(P<0.05);给予Duox1抑制剂、自由基清除剂或PKC抑制剂及PKCδ/θ抑制剂后,ROS生成受到明显抑制,Duox1和MUC5AC mRNA及蛋白表达减少(P<0.05);给予PKCα/β后,ROS生成、Duox1和MUC5AC mRNA及蛋白表达与HNE组比较无明显变化(P>0.05)。结论:体外细胞模型实验中,HNE可通过PKCδ/θ-Duox1-ROS介导MUC5AC高表达,在气道黏液高分泌发展过程中起重要作用。