基于双重猝灭分子信标及核酸染料Hoechst 33258对单链核酸的双色定量检测

利用鸟嘌呤(G)碱基和有机猝灭基团Black Hole Quencher1(BHQ-1)对荧光基团6-羧基荧光素(6-Carboxyfluorescein group,FAM)的双重猝灭作用构建了一种结构简单的双重猝灭分子信标,结合核酸染料Hoechst 33258,以艾滋病毒RNA片段的反转录序列(33个碱基)为目标DNA,建立了一种高灵敏单链核酸(ssDNA)的双色荧光定量检测方法。此分子信标中,荧光基团及有机猝灭基团分别设计为FAM和BHQ-1,分子信标的茎的碱基全部设计为C-G碱基对,环的碱基序列设计为目标DNA的互补序列,与BHQ-1相连接的为3个带有G碱基的核苷酸。没有目标DNA时,分子信标呈茎-环结构,荧光基团FAM与有机猝灭基团BHQ-1及G碱基距离很近,在BHQ-1及G碱基的双重猝灭下,FAM的荧光很弱;另外,分子信标的茎的碱基全部是C-G碱基对,不能与核酸染料Hoechst 33258相结合,因此Hoechst 33258的荧光也很弱。当有目标DNA存在时,分子信标的环与目标DNA杂交形成双链,茎-环结构被破坏,FAM远离猝灭基团BHQ-1及G碱基,其荧光得到恢复;同时,核酸染料Hoechst 33258与双链DNA中的A-T碱基对相结合,其荧光显著增强。根据荧光基团FAM及核酸染料Hoechst 33258荧光增强的程度可实现对ssDNA的定量检测。在优化的条件下,目标DNA的浓度在0.05~8.0nmol/L范围内时,FAM和Hoechst 33258的总荧光强度(ΔIT)与目标DNA的浓度(C)具有良好的线性关系,回归方程为ΔIT=192.2C+115.08(R^2=0.9938),检出限为20pmol/L(3σ,n=9)。此方法操作简单、灵敏度高、选择性好、检出限低。