牛病毒性腹泻病毒和牛冠状病毒双重纳米RT-PCR检测方法的建立及应用

本文建立了一种同时检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛冠状病毒(BCoV)2种病原的双重纳米RT-PCR方法。采用BVDV 5′-UTR基因序列(GenBank登录号:AB040132.1)和BCoV的N基因保守序列(GenBank登录号:KX982264.1)设计出一对BVDV特异性引物和一对BCoV的特异性引物,结果表明此方法对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)和牛轮状病毒(BRV)均无交叉反应,特异性良好。同时,应用此方法检测33份腹泻牛的临床样品和25份腹泻鹿的临床样品,结果得出BVDV、BCoV和2种病原混合感染的牛样品阳性率分别为15.15%、36.36%和6.06%。鹿样品感染BVDV、BCoV和2种病原混合感染的阳性率分别为28%、8%和8%。此外,敏感性试验结果为常规RT-PCR敏感性的10倍,最低检出限为1 fg。研究表明,本文建立的该方法快速、灵敏、简捷,具有较强的特异性、敏感性,可适用于大批量临床样品检测,为反刍动物相关病毒性腹泻的诊断和防控提供一定技术支撑。

鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株双重纳米RT-PCR检测方法的建立和应用

为了建立快速高效鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)经典株与变异株的检测方法,本研究参照GenBank中PEDV经典株CV777和变异株CH-HB1-2018的S基因序列,设计了3条特异性引物,并以纳米金颗粒作为热导介子,通过优化PCR反应条件,建立了能够区分PEDV经典株和变异株的双重纳米RT-PCR检测方法。利用该方法同时检测PEDV经典株和变异株、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型和3型(PCV2和PCV3)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV),结果显示,该方法能特异性鉴别PEDV经典株(747 bp)和变异株(442 bp),且与其他病原均无交叉反应,特异性较强;将重组质粒标准品10倍倍比稀释后分别利用该方法和普通RT-PCR同时检测,结果显示,本研究建立的双重纳米RT-PCR方法能检测出经典株CV777和变异株CH-HB1-2018重组质粒标准品的下限分别为5.68×10^(2)拷贝/μL和4.93×10^(2)拷贝/μL,其敏感性较普通RTPCR的敏感性高100倍。利用本研究建立的方法对不同地区采集的阳性病料提取基因组后分别于同一时间和不同时间进行检测,结果显示该方法稳定性和重复性良好。利用该双重纳米RT-PCR方法对34份采集自河北省腹泻仔猪的样品进行检测,结果显示与普通RT-PCR检测结果符合率为97.1%,且PEDV变异株的阳性率高于PEDV经典株。本研究建立的双重纳米RT-PCR方法为PEDV病原鉴别检测及流行病学调查提供了可行的技术手段。

鹅星状病毒基因Ⅰ型和Ⅱ型双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

鹅星状病毒(goose astroviruses,GAstV)作为一种雏鹅新发病原,对养鹅业造成巨大经济损失,在尚无有效治疗手段情况下,加强疫病及时检测和防控十分重要。为建立快速、特异且灵敏的鉴别GAstVⅠ型和GAstVⅡ型的病毒检测方法,本研究根据GAstVⅠ和GAstVⅡ的保守区域RdRp基因序列,设计合成2对特异性引物和2种不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了一种双重荧光定量PCR检测方法,以达到在同一反应体系中同时定量检测GAstVⅠ和GAstVⅡ的目的。结果显示,GAstVⅠ和GAstVⅡ的最小检出量分别为43.3、6.49 copies·μL^(-1);重复试验的变异系数不超过0.5%;该方法对DPV、GPV、GTMUV、GRV、AIV(H9N2)等病毒核酸无交叉反应。综上表明,本研究建立的可鉴别GAstVⅠ和GAstVⅡ的双重荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强、重复性好。可用于临床GAstVⅠ和GAstVⅡ的快速鉴别诊断,也可用于两种基因型GAstV的定量分析。

犬瘟热病毒与犬冠状病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立鉴别检测犬瘟热病毒(CDV)和犬冠状病毒(CCoV)的方法,本研究采用PCR方法分别扩增CDV N基因和CCoV S基因,并克隆至pMD18-T载体中构建重组质粒pCDV-N、pCCoV-S,均经PCR和测序鉴定后测定浓度作为质粒标准品。同时针对CDV N基因和CCoV S基因设计特异性引物和TaqMan探针,采用方阵试验对各反应条件的优化,建立了同时检测这两种病毒的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。利用10倍倍比稀释的质粒标准品按照该方法检测,建立标准曲线,结果显示,两个重组质粒标准品均与各自的Ct值具有良好的线性关系。采用该方法分别检测CDV、CCoV、犬细小病毒、犬传染性喉气管炎病毒2型、犬副流感病毒,评估该方法的特异性;将两种质粒标准品分别10倍倍比稀释并等体积混合后,取108~101稀释度的质粒混合物作为模板,采用该方法检测,评估该方法的敏感性;将两种质粒标准品10倍倍比稀释并等体积混合后,分别取107、105、103稀释度的质粒标准品混合物采用该方法检测,评估该方法的重复性。结果显示,该方法仅能特异性扩增CDV和CCoV,与犬的其他病毒均无交叉反应,特异性较强;对CDV质粒标准品的检测限为5.0×103拷贝/μL,对CCoV质粒标准品的检测限为4.93×103拷贝/μL,敏感性较高;组内和组间的变异系数均小于3%,重复性较好。利用本实验建立的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法和已报道的CCoV RT-PCR及国标规定的CDV RT-PCR方法同时检测采集的100份临床腹泻犬样品,结果显示,共检出35份阳性样品,其中,CDV的阳性检出率为16%(16/100),CCoV的阳性检出率为19%(19/100),阴性样品65份,与CCoV和CDV参考方法的检测结果均一致。本研究建立的CDV和CCoV双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法可在40 min内完成检测,且准确、快速、敏感,为CDV和CCoV临床大量样品的快速和特异性鉴别检测提供了有效技术手段。

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究根据PRRSV GL膜蛋白基因和CSFV多聚蛋白基因,分别设计2对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果表明,该方法只对猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒特异性良好,不与非洲猪瘟、猪圆环病毒Ⅱ型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒等常发猪病存在交叉反应;PRRSV和CSFV的检出下限分别为1.41拷贝/μL和1.6拷贝/μL;组内和组间Ct值变异系数都小于1.3%。对175份临床采集的样品检测,PRRSV单一阳性样品27份,CSFV单一阳性样品16份,检测双阳性样品24份。本方法敏感高、特异强,可以用于猪场的快速检测与诊断。

双层纳米孔的制造与应用

由于具有孔径可调节、物理化学性质稳定、极端环境适应性强、集成度高等优点,固态纳米孔逐渐成为最具潜力的单分子测序工具。在固态纳米孔发展过程中,提高其单分子检测精度一直是研究人员关注的重点。近年来,双层纳米孔受到了广泛关注。与传统的单层纳米孔相比,双层纳米孔具有的孔-腔-孔结构提供了2个分子识别位点和纳米受限空间。双孔提供的2个分子识别位点可以在单次过孔事件中获得2次目标信号,所获得的双重检测信号不仅丰富了检测信息,也为信号分析提供了最为直接的对比信息源。此外,双层孔中的空腔还可作为单分子化学反应器。因此,双层纳米孔的出现拓宽了纳米孔传感器的应用范围,在单分子检测方面具有广阔的应用前景。本文概述了纳米孔的发展历程,并重点介绍了双层纳米孔的制造方法及其在单分子检测领域的应用。

海藻酸钠-纳米氧化锌复合膜的制备及表征

为改善海藻酸钠膜的性能,并赋予其一定的抑菌性。以海藻酸钠为成膜基材,添加不同含量的纳米氧化锌作为抗菌、抗紫外物质,制备一种具有抗菌、抗紫外双重功能的复合包装薄膜。借助紫外光谱、X射线衍射图谱等对复合膜结构进行表征,对复合膜的机械性能、阻湿性能及光学性能进行测试并分析。结果表明,纳米氧化锌的加入没有改变海藻酸钠膜的结构,复合膜有较强的抗紫外性能,纳米氧化锌与海藻酸钠相容性良好;复合膜具有抗菌性,对金黄色葡萄球菌的抑菌效果强于大肠杆菌。纳米氧化锌的加入提高了复合膜的机械性能与阻湿性能,当纳米氧化锌含量为5%时,有最大的拉伸强度17.13 MPa,最小的水蒸气透过系数8.05×10^(-11) g/(m·s·Pa)。ALG-5%ZnO为最佳配比的复合膜。研究为纳米氧化锌在包装薄膜领域的应用提供参考。

可调控结构色互穿纳米水凝胶的合成及凝胶化转变

研究合成了具有温度和pH响应性的PNIPAM/PAphe互穿纳米水凝胶,通过红外光谱、扫描电镜、动态光散射仪、光纤光谱仪等技术,详细研究了互穿纳米水凝胶的结构和形貌、粒径与分散性、温度和pH响应性、结构色调控与光子晶体自组装,以及凝胶化转变行为。根据红外光谱和扫描电镜图确认了两种网络的有效互穿和其良好的单分散性。通过粒径分析可以得到随着PAphe含量的增加,互穿纳米水凝胶的粒径相应增大,但单分散性保持良好。利用温度和pH敏感性实验证明了该互穿纳米水凝胶的智能调控响应性,具体表现为:在温度上升或pH值下降的条件下,其粒径显著减小。结合光纤光谱图,进一步发现该互穿纳米水凝胶能够通过调整粒径大小来实现其结构色的可调控性。更为重要的是,通过试管倒置法发现在相变温度(32℃)以上该纳米凝胶具有从溶胶转变到凝胶的能力,展现了其在高度可调控的光学材料及生物医学领域中的应用潜力。

鸭甲肝病毒基因A型和C型双重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测基因A型和C型鸭甲肝病毒(DHAV-A,DHAV-C)的双重RT-PCR方法,本实验根据GenBank中DHAV-A和DHAV-C全基因组序列,针对DHAV-A的3C、3D和DHAV-C的2C区域分别设计了2对引物,通过对反应体系和反应条件的优化及特异性、灵敏度评价,建立了检测DHAV-A和DHAV-C的双重RT-PCR方法。该方法能够分别从DHAV-A、DHAV-C阳性样本中扩增出DHAV-A(259 bp)和DHAV-C(194 bp)的特异片段,而不与其它被检的无关病原发生非特异反应;对DHAV-A和DHAV-C的最低检出限分别为4.98×104拷贝/μL、1.68×104拷贝/μL;对2009年8月至2011年7月送检病料检出DHAV-A和DHAV-C的阳性率分别为20%(14/70)、70%(49/70);随机抽取的DHAV-C PCR阳性样本的病毒分离结果与双重RT-PCR检测结果的符合率为100%(16/16)。本研究结果显示,建立的双重RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可用于临床DHAV的快速鉴别诊断。

甘薯羽状斑驳病毒和褪绿矮化病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中公布的甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)外壳蛋白(CP)基因和甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)热激蛋白(Hsp70)基因序列保守区域设计了2对特异性引物,通过RT-PCR反应程序的优化,建立了能同时检测SPFMV和SPCSV的双重PCR检测体系。该检测体系能够1次扩增出SPFMV和SPCSV的特异性片段,片段大小为461bp和304bp,测序结果表明,2种病毒序列与参考序列的同源性达93%以上。

双重RT-PCR快速检测H7N9流感病毒方法的建立

为建立简便快速检测H7N9亚型流感病毒的方法,根椐Gen Bank中H7亚型流感病毒的HA基因序列和N9亚型流感病毒的NA基因序列,设计2对特异性引物,在建立H7亚型和N9亚型单项RT-PCR的基础上,优化双重RT-PCR反应条件,建立同时检测H7亚型和N9亚型的双重RT-PCR。对H7N9亚型流感病毒核酸模板进行双重RT-PCR扩增,结果可同时扩增HA基因263bp、NA基因520 bp的特异性片段,而对其他常见亚型的流感病毒的RT-PCR扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,该双重RT-PCR方法的检测下限为3 pg的H7N9病毒模板。利用该双重RT-PCR方法对30份临床样品进行H7N9病毒进行检测,与病毒分离方法进行对比,结果显示,两者的符合率为100%。结果表明建立的双重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、敏感、准确的特点,可用于H7N9流感病毒的同时检测和鉴别诊断,为H7N9亚型流感的有效防控提供技术支撑。

甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和矮化退绿病毒(SPCSV)的双重RT-PCR检测技术体系构建

在大田生产中,甘薯极易受到甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)和甘薯矮化退绿病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)的混合侵染,导致甘薯产量和品质严重下降,因此构建能同时检测SPFMV和SPCSV两种病毒的检测技术体系对甘薯病毒病(sweet potato virus disease,SPVD)的预防具有重要意义。RT-PCR病毒检测技术具有灵敏度高、特异性强的优点。针对SPFMV和SPCSV病毒分别设计4对和3对特异性引物,通过单一RT-PCR检测技术筛选出特异性强的引物和最佳退火温度;在双重RT-PCR检测体系中,针对SPFMV和SPCSV两种病毒的引物浓度组合设置5个处理,优化双重RT-PCR病毒检测技术体系。单一RT-PCR检测结果表明,SPFMVS2/A2和SPCSVS2/A2引物的特异性最强,目的片段大小为461bp,对于SPCSV病毒来说,SPCSVS2/A2引物的特异性最强,目的片段大小为304bp,最佳退火温度为56℃;在双重RT-PCR检测技术体系中,SPFMV/SPCSV的引物组合浓度比为1∶3时,目标片段扩增效果最好。对两种病毒最低检测浓度的测试结果表明,SPFMV和SPCSV两种病毒RNA的最低检测浓度相当于模板RNA浓度的10-4μL。双重RT-PCR检测技术体系的构建,为大田生产中受SPFMV和SPCSV共侵染的甘薯病毒病的预防提供技术支持。

一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立一种汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)和汉城病毒(Seoul virus,SEOV)双重实时定量荧光RT-PCR检测方法。方法根据HTNV和SEOV S基因设计引物和探针、优化反应条件,建立2种汉坦病毒的双重实时荧光定量RT-PCR方法。以甲型流感病毒、登革热病毒、新布尼亚病毒、寨卡病毒、新冠病毒阳性核酸为模板验证方法的特异性,将建立的方法与巢氏RT-PCR比较,确定方法对临床样本的适用性。结果建立了一种HTNV和SEOV双重实时定量荧光RT-PCR检测方法,该方法对2种型别病毒的最低检测限均为10 copies/μL,不同浓度标准品Ct值批内和批间差异均小于2%。与登革热病毒、新布尼亚病毒、寨卡病毒、新型冠状病毒、甲型流感病毒均无交叉反应。对10份肾综合征出血热急性期血清样本进行检测,结果9份为HTNV、1份为SEOV,与巢式RT-PCR方法结果一致。结论建立的双重实时荧光定量RT-PCR方法可以快速对HTNV和SEOV进行分型和定量检测,适用于肾综合征出血热临床早期诊断。

猪嵴病毒和猪星状病毒双重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测猪嵴病毒(PKV)和猪星状病毒(Ast V)的检测方法,本研究根据PKV 3D基因和Ast V ORF2基因设计了两对特异性引物,通过优化反应条件,首次建立了PKV和Ast V双重RT-PCR检测方法。该方法可以同时扩增出PKV的358 bp和Ast V的938 bp特异性片段,而对猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒及大肠杆菌等病原核酸扩增结果均为阴性,具有较强的特异性;对PKV和Ast V的最低检出量分别为1.51×106拷贝/μL和1.19×106拷贝/μL;利用该方法和单项RT-PCR方法对35份来自四川省部分猪场的仔猪腹泻病料样品进行检测。结果显示,PKV和Ast V的阳性检出率分别为80%和31.4%,两者符合率为100%。本研究建立的方法对PKV和Ast V的鉴别诊断和混合感染检测具有重要的应用价值。

兰花两种主要病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据建兰花叶病毒（Cymbidium mosflic virus，CymMV）和齿兰环斑病毒（Odontoglossumringspotvirus，ORSV）这两种主要兰花病毒的保守序列设计特异性引物，在CymMV和ORSV单一RT～PCR优化体系的基础上。建立了同时检测CymMV和ORSV的双重RT—PCR检测方法。此方法可特异性地从感染CymMV和ORSV的样品中扩增出2条目的带，即CymMV（781bp）和ORSV（588bp）。扩增产物测序表明，CymMV扩增产物与GenBank中登陆的分离物核苷酸同源性为84％～97％，ORSV扩增产物与GenBank中其它分离物的核苷酸序列同源性为98％-99％。运用该方法对随机抽取的田间样品及组培苗样品进行检测，都得到了特异性扩增条带，其灵敏度达到了10^-5。

尼帕病毒与猪流感病毒双重荧光定量RT-PCR方法的建立

根据尼帕病毒(NiV)M基因和猪流感病毒(SIV)M基因序列设计引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立了一种鉴别NiV和SIV的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法,对该方法的定量线性范围、敏感性、重复性和特异性进行了评价及初步应用。结果显示,用该方法检测NiV M基因的RNA标准对照(NiV-M-RNA)和SIV M基因的RNA标准对照(SIV-M-RNA),定量线性范围分别为4.6×101copies/μL^4.6×108 copies/μL和5.8×101copies/μL^5.8×108 copies/μL,检出限分别为46个拷贝和58个拷贝。该方法的组内试验和组间试验的变异系数均小于1.6%,显示其良好的可重复性。该方法仅对NiV-M-RNA和SIV呈现特异性扩增曲线,不与猪瘟病毒(CSFV)、猪流行腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)和伪狂犬病病毒(PRV)发生交叉反应。用该方法对236份猪的鼻拭子样品进行NiV和SIV的同时检测,所有样本的NiV检测结果均为阴性,有1份样本的SIV检测结果为阳性。本研究建立的方法可为猪临床样本中NiV和SIV的鉴别检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。

猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR诊断方法的建立

猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪Delta冠状病毒(PDCoV)已经成为养猪行业的主要疫病。建立能够同时检测且能区分这2种病毒感染的诊断方法,对于临床实践具有重要意义。根据GenBank中登录的PEDV和PDCoV基因序列,分别用PDCoV M基因和PEDV M基因设计了2对引物,并对PEDV的M基因片段和PDCoV的M基因片段进行扩增,通过对PCR反应条件的优化,建立了检测PDCoV和PEDV双重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法。特异性和敏感度的试验表明,此方法对PDCoV和PEDV核酸的最低检测量分别为3.27×10~3拷贝/μL和3.63×10~4拷贝/μL,具有较高的敏感度;该方法可同时扩增出340 bp(PDCoV)和520 bp(PEDV),但不能扩增出猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒、猪博卡病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒。多重PCR与单一PCR符合率100%。表明此方法可以用于PDCoV和PEDV的检测。

猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒一步法双重RT-PCR检测方法的建立与应用

本研究旨在建立一种用于临床腹泻病例中猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)快速检测的一步法双重RT-PCR方法。根据GenBank中收录的PEDV和TGEV的基因序列,分别设计两对特性引物,经最佳反应条件的优化和选择,结果显示,该一步法双重RT-PCR检测方法能同时特异性扩增PEDV和TGEV,该方法可检测到稀释度1×10-5的疫苗毒。应用本方法检测2015年度实验室收集的疑似样品,PEDV阳性率为100%。本研究建立的方法快速、敏感性高、特异性强,可用于临床PEDV和TGEV的快速检测及流行病学调查。

猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR方法的建立

本研究根据GenBank中发表的猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的基因组序列,设计筛选出两对用于双重RT-PCR反应的特异性引物,通过对特异性、灵敏性和稳定性等试验,建立了检测猪流行性腹泻病毒和猪瘟病毒的双重RT-PCR核酸检测技术。利用建立的CSFV-PEDV双重RT-PCR核酸检测技术,对某规模化猪场病料进行检测,结果表明,扩增出大小约311 bp和501 bp大小的特异性条带,为猪瘟与猪流行性腹泻病毒混合感染。建立的CSFVPEDV双重RT-PCR核酸检测技术具有良好的特异性、灵敏性和稳定性,该方法的建立为CSFV和PEDV的快速诊断、疫情监测及流行病学研究奠定了基础。

双重RT-PCR方法检测猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒

为建立特异、敏感的猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的双重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank登录的SIVM基因保守序列和PRRSV美洲型毒株的N基因保守序列,设计合成了2对特异引物,通过对扩增条件的优化,建立检测SIV和PRRSV的双重RT-PCR方法。检测结果显示:该方法可同时扩增出SIV(345bp)和PRRSV(520bp)的特异性片段;而猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型及阴性鸡胚尿囊液核酸扩增结果均为阴性;对SIV和PRRSV2种病毒混合液的最小检出量分别为102EID50/0.1mL和103TCID50/0.1mL。应用双重RT-PCR和病毒分离法对12份临床疑似样品进行对比检测,结果表明:除双重RT-PCR检测到双阳性的3份混合感染病料中1份未分离到PRRSV外,其余2份均分离出病毒。证明该方法具有良好的特异性、敏感性,可以用于临床样品的早期快速检测。