双重聚合酶链反应法早期诊断军团菌肺炎的初步研究

目的 探讨双重聚合酶链反应 (DPCR)法检测痰及支气管肺泡灌洗液 (BALF)中军团菌DNA在早期诊断军团菌肺炎的意义。方法 用DPCR对军团菌肺炎组 (15例 )和普通肺炎组 (31例 )患者病程早期留取的痰及BALF进行军团菌DNA检测。用军团菌 16SrRNA基因和mip基因序列引物 ,可扩增 386bp 16SrRNA基因片段和 2 0 6bpmip基因片段。通过模拟标本来检测DPCR方法用于临床标本时的灵敏度。结果 军团菌肺炎组患者痰、BALF的DPCR结果均为阳性 ,其中 13例患者留取的 2 3份痰、7份BALF标本 386bp 16SrRNA基因片段和 2 0 6bpmip基因片段的扩增结果均阳性 ,余 2例患者留取的 2份痰和 1份BALF标本单一 386bp基因片段扩增阳性。DPCR结果与血清军团菌抗体结果相符。普通肺炎组患者痰和BALF的DPCR结果均为阴性。同一患者留取的多份标本呈现相同的DPCR结果。模拟痰和BALF的DPCR最低检出限均为 1× 10 3 cfu/ml。结论 采用DPCR法检测痰和BALF中的军团菌DNA ,具有较好的敏感性、特异性和稳定性 。

双重式聚合酶链反应检测印鼠客蚤鼠疫菌的观察

为建立蚤类感染鼠疫的快速诊断方法 ,应用双重式聚合酶链反应 (PL- FI- PCR)技术 ,对感染鼠疫菌的 4 0只印鼠客蚤进行检验 ,同时单体拉胃培养作比较。结果显示细菌培养阳性 2 2只 ,双重式聚合酶链反应阳性 4 0只 ,阳性率后者明显高于前者 ,且特异性扩增带比较清晰、典型、稳定。

用双重式聚合酶链反应技术检测鼠疫现场材料的应用研究

采用双重式聚合酶链反应 (Pla- F1- PCR)技术 ,对文山县鼠疫现场部分材料经 8% Clexe- 10 0处理后进行扩增 ,以探讨本法在现场的应用 ,结果从采集的 11份材料 (鼠类 10份 ,病人淋巴穿刺液 1份 )中扩增出 4份阳性 ,高于常规实验诊断 。

双重荧光定量聚合酶链反应技术在食品微生物检验中的应用

随着人民生活水平的不断提升,使得人们逐渐对食品安全产生了更高的重视程度。这一背景下,在食品进入到市场之前,需要采取各种方式对食品进行检验,以及时发现存在安全问题的食物,并禁止进入到市场中,从而向社会群众提供安全性较高的食物。双重荧光定量聚合酶链反应技术是其中较为常见的检测技术,用于对食品微生物含量的检测。基于此,本文通过对双重荧光定量聚合酶链反应技术的介绍,进而分析了其在食品微生物检验中的具体应用,之后以此为基础,阐述了技术应用时的注意事项,以更好地开展食品微生物检测工作提供支持。

13种链球菌超抗原基因的双重实时荧光PCR检测方法的建立

目的建立一新的快速的链球菌超抗原基因检测方法,能快速、灵敏及特异地分析样本中存在的各种超抗原基因。方法根据13种链球菌超抗原基因的保守序列设计特异性引物和探针,利用13种超抗原的阳性标本作为模板来优化了反应体系与扩增条件,并验证其特异度与灵敏度。结果利用该研究建立的双重荧光PCR方法体系,可以特异性鉴定出13种链球菌超抗原,并且与其他呼吸道病原菌也没有交叉反应。另外,该检测体系的检测灵敏度高于普通PCR至少1-2个数量级（10-100倍）及以上。结论该研究建立的双重实时荧光PCR法能更加准确、快速地对链球菌菌株中的超抗原基因进行检测分析。

双重荧光定量聚合酶链反应检测烟曲霉菌与黑曲霉菌的临床应用

目的建立检测烟曲霉菌和黑曲霉菌的双重荧光定量聚合酶链反应方法,探讨其临床应用价值,为快速准确地鉴定侵袭性曲霉菌寻求新的检测技术。方法设计可扩增烟曲霉菌和黑曲霉菌18sRNA引物和探针,建立双重荧光定量聚合酶链反应体系并进行方法学评价;选取45例临床确诊的侵袭性真菌感染(IF)患者和20例阴性健康对照者的全血,应用本方法对以上两种真菌进行DNA检测;结果与常规鉴定方法比较,评估该方法的敏感性和特异性。结果对于纯化后的烟曲霉菌和黑曲霉菌DNA,该方法的敏感性为1拷贝,特异性达到100%,批内和批间试验均显示了较好的重复性;临床标本检测结果显示,该方法与常规方法比较,敏感性和特异性均为100%。结论应用双重荧光定量聚合酶链反应方法同时检测烟曲霉菌和黑曲霉菌具有良好的敏感性、特异性和重复性,与常规鉴定方法结果相符,有利于烟曲霉菌和黑曲霉菌感染的早期快速诊断和实现对进展期感染者的动态监测。

利用双重TaqMan荧光定量聚合酶链反应技术鉴别诊断粪便标本中的伤寒和甲型副伤寒沙门菌

目的建立针对粪便标本中伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌的检测方法,评价该方法的特异性、敏感性及检测下限,以提高感染人群粪便标本中两种病原的检出效率。方法分别根据伤寒沙门菌特异基因STY1633及甲型副伤寒沙门菌特异基因SPA4289设计特异性引物及探针,优化反应条件,建立双重TaqMan荧光定量聚合酶链反应(dual taqman fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)体系。利用44株伤寒沙门菌、30株甲型副伤寒沙门菌、88株其他血清型沙门菌染色体DNA及引起发热的其他病原菌,评价该方法的特异性和灵敏性,并对伤寒沙门菌及甲型副伤寒沙门菌的粪便模拟标本进行检测下限评价,同时利用10份伤寒患者、20份甲型副伤寒患者及48份其他病原所致发热和/或伴腹泻的患者粪便标本进行特异性、敏感性验证。结果利用本方法检测的伤寒、副伤寒沙门菌纯菌及伤寒、甲型副伤寒患者标本扩增阳性,其余的非伤寒沙门菌、致腹泻的其他5种肠道致病菌及引起发热症状的8种常见非肠道病原菌纯菌及相应患者标本均扩增阴性。在对纯伤寒沙门菌DNA及甲型副伤寒沙门菌DNA检测中,双重TaqMan荧光定量PCR法的最低检测限分别为1 pg/反应(194拷贝/反应)及2.5 pg/反应(485拷贝/反应)。以粪便模拟样品提取DNA为模板的检测中,增菌前伤寒沙门菌检测下限达102cfu/g,增菌后可达1 cfu/g;增菌前甲型副伤寒沙门菌检测下限达104cfu/g,增菌后可达10 cfu/g。结论本研究建立了特异性好、灵敏度高的检测粪便中伤寒沙门菌及甲型副伤寒沙门菌的双重TaqMan荧光定量PCR方法,为伤寒及甲型副伤寒疾病的同时快速诊断及鉴别诊断、某些不明原因发热及腹泻症状的病原的初步鉴定提供了简易手段。

应用双重实时荧光定量反转录-聚合酶链反应方法同时检测A组轮状病毒和星状病毒

目的建立能同时检测轮状病毒A群和星状病毒双重实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(rRT-PCR)方法。方法根据上述2种病毒基因组保守序列设计引物和探针,建立并分析多重rRT-PCR的重复性、特异性、敏感性;以所建立方法对128例病毒性腹泻患者粪便标本进行检测,同时以基因测序进行验证。结果所建立的双重rRT-PCR检测方法对轮状病毒A群和星状病毒具有很好的特异性和重复性,轮状病毒A群灵敏度达到每个反应101拷贝,星状病毒灵敏度达到每个反应102拷贝。128例粪便标本中,轮状病毒A群和星状病毒的检出率分别为18.0%和3.1%。通过基因测序比对结果相符。结论构建可用于轮状病毒A群及星状病毒的双重rRT-PCR方法快速、特异且灵敏,可用于临床病原诊断和流行病学调查。

基于双重PCR技术的鹿茸及其伪品DNA指纹特征和鉴定

目的:分析鹿茸线粒体细胞色素b(Cytb)和细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因特异性,建立双重PCR技术鉴别鹿茸真伪的分子指纹特征。方法:利用碱变性法提取梅花鹿茸、马鹿茸、驯鹿茸和新西兰鹿茸的基因组DNA,应用引物设计软件Premier 5.0针对Cytb和COⅠ分别设计特异性引物(分别为Cytb 1、2和COⅠ1、2、3),采用单一及双重引物分别进行PCR扩增,筛选特异性强的引物,确定最佳PCR反应条件。结果:采用碱变性法提取的鹿茸基因组DNA片段长度为23 000bp,DNA纯度即A(260)/A(280)为1.80±0.02;应用单一引物进行PCR扩增无法鉴定鹿茸的真伪,而引物Cytb 1和COⅠ1组合后,解链温度为58℃时,梅花鹿茸(吉林、安徽)、马鹿茸均能扩增出395和525bp大小的2个片段,而驯鹿茸和新西兰鹿茸均未能扩增出相应片段;采用该提取方法及最优化的PCR反应条件,对市售样品进行检测,检测结果与实际情况完全一致。结论:双重PCR技术可从分子水平鉴别鹿茸的真伪,该方法特异性高、实用性强,且简便快捷,在鹿茸真伪鉴别方面具有较高的应用价值。

疟疾双重PCR检测方法的建立和初步应用研究

目的建立一种适合于我国恶性疟、间日疟和两者混合感染地区,一次性检测人体内或蚊体内的恶性疟原虫(P.f.)和间日疟原虫(P.v.)的双重聚合酶链反应(PCR)法.方法根据疟原虫红内期SSUrRNA基因特定片段,设计合成3条寡核苷酸特异引物,在一个反应体系中,同时检测P.f.与P.v.的双重PCR技术,操作方法按PCR常规.结果从P.f.和P.v.感染血样中,分别扩增出274bp和412bp的特异片段,检出水平达1～5个虫/μl血,而人基因组DNA、约氏疟原虫、伯氏疟原虫均未见扩增条带;但食蟹猴疟原虫(P.c.)与P.v.相似,在412bp可见扩增条带.经对采自不同疟区发热待查病人的滤纸干血滴和确诊疟疾病人的静脉血检测,344例血样中,检出阴性112例、P.f.109例、P.v.114例、P.f.+P.v.9例,阳性率67.4%;比常规镜检的阳性率66.3%稍高,尤以检出P.f.+P.v.感染病例高.分别检测人工感染P.f.与P.v.各10只大劣按蚊的阳性唾腺,均被检出同种的阳性结果.结论一次性检测P.f.DNA与P.v.DNA的双重PCR法,敏感性高,特异性强,稳定性好,具有简化操作、提高工效、降低耗费的优点.对发热待查病人诊断和蚊媒感染疟原虫调查,以及疟疾病原学的检测质控方面,均有实用价值.

应用双重PCR检测海南疟区发热病人的效果

目的 评价双重PCR检测疟区发热病人的效果。方法 对疟区求诊发热病人 ,手指取血分别制作厚薄血膜片和滤纸血斑作为检测血样。参照文献用恶性疟原虫PF1 - 2 和间日疟原虫PV3 - 5为特异性引物 ,同在一个反应体系常规进行PCR ,扩增片段分别为 2 0 6bp和 431bp。同时镜检厚血膜作对照。结果 该反应体系最低可检出原虫血症为1个恶性疟原虫 μl血和 10个间日疟原虫 μl血的感染 ;检测 132例疟区发热病人血样的阳性率为 6 5 .1%,而镜检法为6 4.4%,且有 1例漏诊和 3例误诊 ,两法符合率为 97%。结论 双重PCR用于疟区发热病人检测 ,较镜检敏感、特异 ,适合我国恶性疟与间日疟混合流行区的疟疾诊断 ,还可用于血检质量的监控。

一种检测KPC和NDM耐药基因的双重PCR-LF方法建立及初步应用

目的建立一种双重聚合酶链反应-侧流层析(PCR-LF)方法快速检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)和新德里金属β-内酰胺酶(NDM)两种耐药基因。方法根据KPC和NDM的基因保守区,分别设计并合成了特异性引物,建立双重PCR和LF技术相结合的检测体系,通过优化扩增和LF检测体系,将建立起的方法初步应用于临床标本检测。结果双重PCR-LF可用于KPC和NDM两种碳青霉烯酶基因的检测,检测下限均为200 CFU/mL。以药敏表型检测为参考方法,利用双重PCR-LF直接检测120份临床无菌体液标本,两种方法结果差异无统计学意义(P>0.05),Kappa值为0.644,表明一致性较好。结论双重PCR-LF方法用于KPC和NDM两种耐药基因检测快速有效,对于指导临床用药与监控院内细菌碳青霉烯类抗菌药物耐药性的传播具有重要意义。

牛诺如病毒和冠状病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立能同时检测牛诺如病毒(BNoV)和牛冠状病毒(BCoV)的聚合酶链反应(PCR)检测方法,根据BNoV和BCoV基因组的保守区域设计2对特异性引物,预期特异性扩增BNoV和BCoV的片段大小分别为542 bp和896 bp。特异性检测结果显示,该方法能特异性扩增BNoV和BCoV的目的条带,未扩增出其他犊牛腹泻病毒性病原;BNoV和BCoV的最低检测限分别为6.71×10^4 copies/μL和1.38×10^5 copies/μL。对采集自河南地区的127份犊牛腹泻样品的检测结果显示,BNoV的阳性率为6.30%(8/127),BCoV的阳性率为14.96%(19/127),与单项PCR检测结果相一致。结果表明,建立的双重PCR方法可用于BNoV和BCoV的检测及流行病学调查。

炭疽杆菌双重实时荧光PCR检测方法的建立

目的建立同时检测炭疽杆菌capA基因、PA基因的双重实时定量荧光PCR方法,用于应对突发传染病疫情和流行病学调查、突发公共卫生事件应急处置的早期检测及防范生物恐怖威胁。方法设计和合成分别针对炭疽杆菌capA基因、PA基因的引物对和荧光双标记探针,构建质粒标准品,通过优化探针、引物浓度、反应体系试剂组分等参数,建立可同时检测capA基因、PA基因的双重实时荧光PCR方法,测试方法的灵敏度和特异性,并在实战检测中应用。结果双重实时荧光定量PCR的炭疽杆菌capA基因、PA基因检测的灵敏度分别可达到每反应5和50拷贝,并具有良好的特异性,在实战应用中亦经过考验。结论双重实时荧光定量PCR技术具有可以同时筛查、经济、快速、特异性强等优点,在炭疽杆菌检测方面有良好应用价值。

牛病毒性腹泻病毒内标双重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为了对BVDV-1和BVDV-2进行同步检测,针对不同基因型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因组高度保守的5′-UTR核苷酸序列设计特异性引物(扩增长度为288bp)。为了指示假阴性结果,以牛GAPDH基因为内标基因,设计特异性引物(扩增序列长度为152bp)。通过反应条件的优化,建立了BVDV通用型内标双重RT-PCR检测方法,该方法可以监测RNA提取与RT-PCR反应过程,指示假阴性结果的发生。该方法的检测灵敏度约为100TCID50/mL,且具有较好的特异性和可重复性。通过对566份临床样品检验,检测到阳性样品19份,阳性率3.36%。该方法可用于临床样品中BVDV检测,并可对检测结果进行质量控制。

发酵支原体、穿通支原体双重套式PCR检测研究

目的 应用双重套式 PCR技术同时检测发酵支原体 (Mf)和穿通支原体 (Mpe)。方法 以支原体 16 Sv RNA基因为靶基因 ,外套引物为 Mf 与 Mpe共用、内套引物则分别为 Mf 种特异和 Mpe种特异 ,建立双重套式扩增体系。结果 本双重套式 PCR不仅能分别扩增 Mf 和 Mpe的特异性 DNA,并能同时扩增 Mf 和 Mpe出现二条特征性条带 ,产物经测序证实。结论 双重套式 PCR是一种灵敏、特异和快速的 Mf 和

BRSV和BPIV-3双重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速诊断牛呼吸道合胞体病毒(BRSV),牛副流感病毒3型(BPIV-3)病毒病的方法,根据Genbank中登录的BRSV核衣壳蛋白N基因序列和BPIV-3的核衣壳蛋白N基因序列,利用分子生物学软件Primer5.0设计2对特异引物,经过条件优化,建立了BRSV和BPIV-3的双重PCR检测方法。采用该方法检测BRSV和BPIV-3参考毒株,特异性良好。对参考毒株进行梯度稀释检测,结果该方法检测BRSV的敏感性可达10 TCID50·100μL-1,BPIV-3可达10 TCID50·100μL-1。应用建立的双重PCR方法能够从临床样品中检测出BRSV和BPIV-3。表明建立的双重PCR方法具有特异、敏感、快速的特点,可用于BRSV和BPIV-3的临床检测。

禽呼肠孤病毒与禽白血病病毒双重RT-PCR检测方法的建立及应用

根椐GenBank中禽呼肠孤病毒(ARV)、禽白血病病毒(ALV)基因序列,设计2对引物,在建立鉴别各病毒单项RT-PCR技术的基础上,优化双重RT-PCR反应条件,建立2种病毒的双重RT-PCR。对同一样品中的ARV、ALV核酸模板进行双重RT-PCR扩增,结果可同时扩增ARV 485bp、ALV 673bp的特异性片段,而对其他5种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,该双重RT-PCR技术能检出10pg的ALV和10pg的ARV模板。用31份临床病料对本研究双重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的双重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这2种病毒的同时检测和鉴别诊断。

双重荧光定量RT-PCR法检测肠道病毒方法的建立及应用

目的建立检测肠道病毒(EV)、B1型柯萨奇病毒(CVB1)的双重荧光定量RT-PCR法。方法用Primer Express 3.0软件设计特异性引物和探针,优化双重荧光定量RT-PCR反应体系,建立标准曲线并评价该法的灵敏度、特异性和重复性,用该法检测150份病毒性心肌炎患儿治疗前肛拭子和29份治疗后粪便标本,并与文献提供的PCR法进行对比。结果该法对EV、CVB1型肠道病毒检测具有较高特异性,检出限均为2×10-2TCID50/mL;具有较好的重复性,CV均<2.3%;标准曲线的相关系数(r2)分别为0.999和0.997,扩增效率(%)分别为98.809和96.564;179份临床标本用该法检测95份为EV病毒,其中59份为CVB1病毒,与文献提供的PCR法结果符合率为98.88%(P均>0.05)。结论建立的双重荧光定量RT-PCR法可同时检测并区分EV和CVB1型病毒,适用于病毒性心肌炎临床标本的检测。