基于双重聚合酶链式反应技术检测掺假驴乳中的牛乳

目的 建立双重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测驴乳中掺假的牛乳的鉴别方法 。方法 将牛乳按比例掺入驴乳制备掺假乳,经热处理提取DNA,以驴和牛的12S-RNA、16S-RNA为靶标设计特异性引物,进行相应的PCR扩增,优化双重PCR退火温度,同时考察该方法 在巴氏杀菌、高温灭菌和冷冻干燥条件下的适用性及灵敏度。结果 牛和驴的引物特异性均良好,与非目标物种DNA不发生交叉反应,DNA检出限最低为10 ng;优化后的双重PCR最佳退火温度为55.7℃;单重PCR由于干扰因素少,对驴乳中牛乳的掺假检出限均为0.1%,而双重PCR也表现出较好的适用性及灵敏性,在原料乳中检出限为0.5%,巴氏杀菌乳、高温灭菌乳和冷冻干燥驴乳中检出限均为2.0%。相较于单重PCR,双重PCR大大缩短了检测时间成本。结论 本研究为驴乳中牛乳的掺假检测提供了一种准确、灵敏和经济的方法 ,具有实际参考价值。

双重数字聚合酶链式反应定量检测转基因马铃薯EH92-527-1品系

目的建立双重数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)精准定量检测转基因马铃薯EH92-527-1品系的方法。方法基于马铃薯内参UGPase基因和EH92-527-1品系外源插入片段旁侧序列,设计合成引物和探针,确定反应体系和反应条件,建立转基因马铃薯EH92-527-1品系双重数字PCR定量检测方法。对方法的特异性、定量检测范围、定量限、检测准确度进行评估。结果该方法特异性良好,除转基因马铃薯EH92-527-1品系外,其他物种和品系均无扩增;在线性范围内,内参基因和品系特异性基因拷贝数的相对标准偏差值介于0.86%~22.90%,线性决定系数r^(2)>0.99;品系特异性基因的定量限为3拷贝;不同浓度样品EH92-527-1品系含量测定值与真实值之间的偏差分别为1.54、4.92和–1.31。结论方法具有良好的重复性和准确度,可以用于进出口产品中转基因马铃薯EH92-527-1成分的定性定量检测。该方法的建立对于转基因马铃薯及其制品的监控监管、安全评价和风险预警具有重要意义。

双重聚合酶链式反应快速筛查副溶血性弧菌流行株方法应用与评价

目的基于种属特异性tlh基因和典型毒力基因(tdh1_368特异性位点)建立双重聚合酶链式反应(duplex PCR,DPCR)检测副溶血性弧菌(VP)体系并评价。方法对建立的DPCR检测体系,用单盲法评估特异性和灵敏度,用人工模拟样品、腹泻标本和水产品进行现场方法学评估。结果该法具有高特异性(100%)和灵敏度(≥1.5 ng/μl),用所建立的方法和培养法平行检测腹泻标本、市售水产品中的VP,阳性率差异无统计学意义,对VP流行株的正确判断率为93.5%(29/31);对腹泻标本24 h内、模拟样品增菌后4~8 h内检测并报告VP大流行株。结论DPCR结合常规样品增菌能加快样品中VP的检测和报告,为及时处理疫情提供技术支持。

检测乙酰微小杆菌的双重实时荧光定量聚合酶链式反应方法的建立

以鲜切叶菜中的乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)为研究对象,建立定量检测E.acetylicum的双重实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)方法。以前期试验发掘到的微小杆菌(Exiguobacterium sp.)的特异性基因P401_RS0117025和E.acetylicum的特异性基因oxi_50582462为检测靶点,对其设计特异性探针,并对反应体系进行优化,以12株E.acetylicum为阳性对照,以4株微小杆菌属内其他种的菌株以及10株非微小杆菌的腐败菌/致病菌作为阴性对照,对建立的RT-PCR进行特异性检测;通过标准曲线的制备、灵敏度、可重复性来评价该方法的有效性。最后,应用该RT-PCR方法对不同贮藏日期鲜切叶菜中的E.acetylicum进行检测。结果表明:本研究设计的探针特异性良好;检测靶点P401_RS0117025与oxi_50582462的标准曲线的R2值分别为0.994和0.999,且重复性好;该方法的DNA检测限为1.629×10^(-7)ng/μL,纯菌菌落检测限为3.4 CFU/m L,并能对鲜切叶菜中的E.acetylicum进行灵敏检测。此外,还建立了"Ct(阈值)-Nt(菌体浓度)"的数量关系,能对供试样品中的E.acetylicum进行绝对定量。总之,本研究建立了准确、灵敏、高效检测食品中腐败菌E.acetylicum的RT-PCR定量方法,为食品货架期预测提供了理论依据。

Taqman探针荧光聚合酶链式反应实时同步鉴定动物源性食品中猪肉、鸡肉源性成分

目的:建立一种能实时同步检测动物源性食品中猪肉源性和鸡肉源性成分的Taqman探针双重荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,应用于动物源性食品的成分掺假快速检验。方法:分别依据猪和鸡的种间保守基因(Cytb)序列设计、合成特异性引物及不同荧光标记(FAM、HEX)的Taqman探针,建立可同步检测动物源性食品中的猪源性和鸡源性成分的Taqman探针双重荧光PCR方法。结果:所建立的Taqman探针双重荧光PCR检测方法特异性强,仅对猪、鸡成分有扩增;灵敏度高,最低检测到猪源、鸡源DNA的含量分别为0.02、0.10 ng;抗干扰性强,当DNA混样中猪源、鸡源性成分含量在2%以上水平时,所建立的混合检测体系均能对DNA混样给出正确判断。结论:所建立的混合检测体系具有高特异性、高灵敏度,能够适用于动物源性食品中猪肉、鸡肉成分的同时快速检测。

猪伪狂犬病病毒与猪圆环病毒2型双重PCR检测方法的建立及初步应用

目的为建立一种能同时鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)混合感染的诊断方法。方法与结果根据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒和圆环病毒2型的基因序列,分别设计一对特异性引物,扩增长度分别为612bp和238bp。将PCR产物进行测序,与PRV"Yangsan"株和PCV2"JX0301"株的同源性分别为98.6%和99.2%。通过反应条件的优化,建立同时检测PRV和PCV2的双重PCR方法。利用该方法对临床采集的78份疑似病料进行检测,其中59份为PCV2阳性,17份PRV阳性,其中11份为PRV和PCV2共感染。结论建立的双重PCR检测方法可以用于PRV和PCV2的临床快速鉴别诊断和流行病学调查。

双重实时荧光聚合酶链式反应检测棘鳞蛇鲭和异鳞蛇鲭

目的建立检测棘鳞蛇鲭(Ruvettus pretiosus, RP)和异鳞蛇鲭(Lepidocybium flavobrunneum, LF)两种油鱼的双重实时荧光聚合酶链式反应(PCR)方法。方法基于棘鳞蛇鲭和异鳞蛇鲭线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因分别设计特异性引物和探针,并对方法进行灵敏度、特异性和重复性分析,建立双重实时荧光PCR方法。结果模板量在8.4×10^5~8.4×10^0 copies/μl范围内,方法具有良好的线性关系,棘鳞蛇鲭和异鳞蛇鲭的线性回归方程分别为y=-3.18x+41.0(R^2=0.998 8)和y=-3.37x+44.5(R^2=0.998 6),方法组内相对标准偏差(RSD)为0.29%~0.84%。其中,检测棘鳞蛇鲭的组内RSD为0.29%~0.84%,检测异鳞蛇鲭的组内RSD为0.29%~0.62%。方法最低检测限为16.8 copies/反应,并且从随机购买的50份鳕鱼样品中鉴定出油鱼成分棘鳞蛇鲭。结论本试验建立的双重实时荧光PCR方法能够特异性地鉴定出棘鳞蛇鲭和异鳞蛇鲭,具有实际应用潜力。

2个杂交籼稻和2个粳稻品种SSR指纹图谱的构建及双重PCR技术的初步研究

用460对水稻SSR引物对5个杂交籼稻及其双亲和16个粳稻品种(系)进行了PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳,筛选出12对稳定性好、多态性高、杂带少的SSR引物作为核心引物,构建了国稻6号和两优培九的SSR指纹图谱。另外,还筛选出9对核心引物,构建了粳稻品种盐稻8号和徐稻4号的分子指纹图谱。其中,筛选出国稻6号的特异性标记5个,两优培九的特异性标记3个,盐稻8号的特异性标记1个,徐稻4号的特异性标记2个。这些特异标记可用于种子纯度的快速鉴定。另外,挑选扩增条带稳定、特异性较好的引物组合,进行了双重PCR分析。

猪圆环病毒2型和猪细小病毒双重PCR检测方法的建立及应用

根椐Gen Bank中登录的猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)核苷酸序列,分别设计2对引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化双重PCR反应条件,建立了2种病毒的双重PCR检测方法,用这2对引物对同一样品中的PCV2和PPV核酸模板进行双重PCR扩增,结果可同时扩增PCV2的245 bp、PPV的475 bp的特异性片段,而对其他4种病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该双重PCR技术能检出1 pg的PCV2和1 pg的PPV模板。用105份临床病料对本研究双重PCR技术和单项PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的双重PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可用于对这两种病毒的同时检测和鉴别诊断。

TaqMan探针双重荧光PCR法检测副溶血性弧菌

目的:建立同时检测副溶血性弧菌(VP)和其毒力基因的方法。方法:根据VP的toxR基因和tdh基因,分别设计引物和探针,建立基于TaqMan探针双重荧光聚合酶链式反应扩增体系,进行特异性、敏感性实验,并用建立的方法检测从广东地区和辽宁地区进出口食品中分离的VP菌株的毒力基因分布情况。结果:VP标准菌株和3株从食物中毒病人中分离株均出现toxR基因和tdh基因扩增曲线,而31株包括溶藻弧菌、单增李斯特菌等弧菌属和肠杆菌科的菌株扩增结果呈阴性;敏感性实验结果表明,VP浓度与Ct值有很好的反向的线性关系,toxR和tdh线性方程的R2分别为0.999、0.997,最低检测浓度达到3.6×102CFU/mL;检测食品中分离的37株VP只出现toxR基因扩增曲线,未见tdh基因扩增曲线,表明37株VP分离株均未带tdh毒力基因。结论:建立的方法特异性好、灵敏度高,可用于食品中VP的特异性及毒力基因检测。

一种基于双重ddPCR的肉制品中牛源性成分的定量分析方法

将低价肉类原料掺入高价肉制品是一种典型的肉类掺假方式,为准确鉴别牛肉及牛肉制品的真伪,建立一种基于双重微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)的牛源性成分定量分析方法。通过对14种动物的Beta-actin单拷贝基因序列进行分析,设计牛源性特异性引物、探针与动物源性成分通用引物、探针并建立双重ddPCR体系,推导出牛源性成分质量与其特异性扩增拷贝数之间的计算公式,对牛源性成分进行定量检测该方法得到牛源性成分质量M_(牛)(mg)与其特异性扩增拷贝数浓度C_(牛)(copies/μL)之间的计算公式为M_(牛)=0.033C_(牛)+2.37,对已知牛肉质量的混合肉样品与不同部位的牛肉样品进行检测,结果显示牛肉定量检测值与实际质量基本一致。同时拷贝数相对含量可辅助判断肉制品中是否存在非牛源性的其他动物源性成分掺假。对市售样品的检测发现,存在目标肉样含量不达标以及不同程度的动物源性成分等掺假现象,说明该检测方法可为牛肉制品掺假量化判定和混合源性产品分级鉴定提供技术支撑。

荚膜型和非荚膜型流感嗜血杆菌双重PCR检测方法的建立和临床应用

目的建立基于流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae,Hi)外膜蛋白P6编码基因omp6和荚膜编码基因bex A的双重PCR检测方法,并确定其检测限、灵敏度和特异度。方法根据Gen Bank公布流感嗜血杆菌的omp6和bex A基因核苷酸序列设计引物,用Hi标准菌株确定其检测限,双重PCR检测289例鼻窦炎患者鼻咽部分泌物(NPS)确定方法的灵敏度与特异度。结果 289例NPS培养阳性率为50.5%,14株为荚膜型;双重PCR检测omp6的阳性率为54.7%,bex A阳性16株。双重PCR与细菌培养及血清凝集试验符合率分别为95.8%和99.3%。检测时模板的下限为3.8 pg/μl。双重PCR检测omp6和bex A基因的灵敏度均为100.0%,特异度分别为91.6%和99.3%。结论建立的双重PCR是一种快速、特异和敏感的Hi感染的检测和分型方法,可代替细菌培养和血清凝集试验用于临床标本诊断。

TaqMan探针双重荧光PCR法检测副溶血性弧菌毒力基因

目的建立同时检测副溶血性弧菌毒力基因tdh和trh的双重荧光PCR方法。方法筛选副溶血性弧菌tdh和trh毒力基因的特异性引物和探针,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR扩增体系,进行特异性、灵敏度实验,并对本实验室保存的54株副溶血性弧菌进行tdh、trh毒力基因的检测,以了解不同来源的副溶血性弧菌携带毒力基因的状况。结果建立的双重荧光PCR方法特异度强(100%),最低检测浓度达到20 cfu/ml,对本实验室保存的副溶血性弧菌进行毒力基因的检测结果显示,从临床分离的10株副溶血性弧菌和海产品样品中分离的1株副溶血性弧菌均为tdh扩增阳性,trh扩增阴性。结论所建立的方法特异性好,灵敏度高,适用于副溶血性弧菌的毒力基因检测。

快速鉴定鹿茸真伪及其种属检测试剂的试验研究

目的:建立1种双重PCR检测体系,根据琼脂糖凝胶电泳目的条带位置及数量快速鉴定花鹿茸、马鹿茸及常见伪品驯鹿茸。方法:采用碱变性法提取鹿茸样品基因组DNA,以鹿科动物Cytb和COI基因为靶序列,应用Primer 3.0,根据SNP位点设计特异性鉴别引物(Cy-1、COI-1),并摸索及优化PCR反应体系及条件,同时,采用克隆及测序验证检测结果的准确性。结果:建立的双重PCR扩增体系显示,花鹿茸在电泳图谱408 bp及146 bp处可见2条扩增条带,马鹿茸则在146 bp处见1条目的条带,而伪品鹿茸则无扩增条带,与质粒克隆测序验证的结果一致。且市售鹿茸样品的检测结果与鉴定结果相吻合。结论:本试验自主构建的双重PCR检测体系简便、迅速,检测试剂结果准确,稳定性良好,在分子水平实现一步法鉴定花鹿茸、马鹿茸及其常见伪品,具有较大实用价值。

PCR法直接检测鲜乳中金黄色葡萄球菌肠毒素A的研究

目的建立一种快速敏感检测鲜乳中金黄色葡萄球菌肠毒素A的方法。方法将金黄色葡萄球菌模拟污染鲜乳后,提取菌体DNA,以大肠杆菌作对照,用双重PCR法扩增金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因和肠毒素A基因。结果在含金黄色葡萄球菌(1×104个/ml)的模拟鲜乳样品中检出金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因和肠毒素A基因,而大肠杆菌对照未出现特异性片段;PCR方法灵敏度分析显示,其检测限为100 cfu/ml。结论建立的直接检测金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因和肠毒素A基因的双重PCR方法,具有速度快、特异性强、灵敏度高和易操作的特性,可用于金黄色葡萄球菌食源性疾病与食物中毒的实验室诊断。