混合血清封闭降低石蜡切片中免疫荧光双重染色非特异性荧光背景的应用

间接法免疫荧光双重染色（indirect immunofluoreseence double-staining）是用未标记荧光素的两种不同种属一抗孵育组织或细胞，再用两种不同荧光素标记的荧光二抗孵育组织或细胞，在普通荧光显微镜／激光共聚焦显微镜下选择两种相应的激发光进行观察，从而对两种抗原分别进行定位和定量的方法。目前，随着AlexaFluor新型窄谱染料”和激光共聚焦显微镜技术的广泛应用”，石蜡切片免疫荧光染色技术的应用越来越广泛。

脑组织双重免疫荧光标记方法介绍

应用光学技术对荧光标记的组织切片样品进行成像观察是生物学研究的常规手段。本文主要介绍如何制备用于荧光显微镜和激光共聚焦显微镜成像的脑组织石蜡切片免疫荧光双重标记技术。

激光共聚焦显微镜观察免疫荧光双重标记的前列腺癌内基质金属蛋白酶及其作用底物的表达

目的:探讨应用激光共聚焦显微镜观察免疫荧光双重标记的前列腺癌标本的可行性及优点。方法:应用激光扫描共聚焦显微镜同时检测前列腺癌中基质金属蛋白酶(MMPs)和其作用底物的表达情况。结果:在激光扫描共聚焦显微镜下,可以清晰地观察MMP-7和层粘连蛋白(LN)可共同表达于前列腺癌细胞及基质中的基底膜、血管平滑肌和神经纤维;MMP-9和Ⅳ型胶原的主要表达于细胞外基质中的基底膜。结论:结合应用激光扫描共聚焦显微镜和免疫荧光双重标记技术能对蛋白进行精确的定位研究。

大鼠中脑切片的酪氨酸羟化酶和谷氨酸双重免疫荧光染色

在大鼠中脑组织切片上进行酪氨酸羟化酶和谷氨酸双重免疫荧光染色。用改良的脑灌注法以降低双重免疫荧光染色时谷氨酸的背景噪音 ,获得了满意的结果。在大鼠中脑腹侧 ,91 %± 4%的多巴胺神经元呈谷氨酸染色阳性 ,从细胞组织学上证明了中脑腹侧多数多巴胺神经元存在多巴胺与谷氨酸递质共存现象。

免疫荧光双重染色在结核分枝杆菌肺炎患者中的诊断应用

目的:探讨免疫荧光双重染色在结核分枝杆菌肺炎患者中的诊断应用价值。方法:选择2019年3月-2021年3月在佳木斯市肿瘤医院诊治的结核分枝杆菌肺炎患者66例作为结核组,同期选择非结核分枝杆菌肺炎患者66例作为非结核组。取所有患者的胸腔积液标本,采用涂片镜检-荧光染色法、免疫荧光双重染色法进行检测,判断检测效果。结果:结核组的胸腔积液腺苷脱氨酶(adenosine deaminase,ADA)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、总蛋白(total protein,TP)、葡萄糖(glutamate,GLU)均高于非结核组(P<0.05)。在66例结核分枝杆菌肺炎患者中,涂片镜检-荧光染色法检出56例,检出率为86.4%;免疫荧光双重染色法检出65例,检出率为98.5%,对比差异有统计学意义(P<0.05)。在两组132例患者中,涂片镜检-荧光染色法的诊断敏感度与特异度为84.8%和98.5%,免疫荧光双重染色法的诊断敏感度与特异度为98.5%和100%。受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)分析显示涂片镜检-荧光染色法与免疫荧光双重染色法的曲线下面积分别为0.822和0.984。结论:免疫荧光双重染色在结核分枝杆菌肺炎患者中的应用诊断敏感度与特异度都在98.0%以上,可提高检出率,可为结核分枝杆菌肺炎的早期诊断提供一定的依据。

量子点联合Cy5双重荧光标记人舌鳞状细胞癌细胞蛋白质的应用研究

目的比较以量子点(quantum dots,QDs)与Cy5荧光染料对人舌鳞癌细胞株Tca8113细胞中热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)和survivin蛋白质进行双重免疫荧光标记时蛋白质的分布及荧光的稳定性。方法以QDs和Cy5荧光染料对Tca8113细胞内HSP70和survivin蛋白质进行双重免疫荧光标记,在激光共聚焦显微镜下同时观察Tca8113细胞内的HSP70和survivin蛋白质表达及分布。激光连续照射2 420 391 ms,用激光共聚焦显微镜自带软件Leica Confocal Software测量QDs和Cy5的荧光信号强度变化。结果激光共聚焦显微镜下可见Tca8113细胞内HSP70和survivin蛋白质均有明显表达,分别表现为绿色和红色荧光,其中两种蛋白质重叠处呈黄色荧光。激光连续照射2 420 391 ms,QDs标记的绿色荧光未见明显衰减,而Cy5荧光染料标记的红色荧光基本淬灭,随着Cy5荧光的淬灭,绿红黄三色通道下所见的红绿黄3种颜色的荧光也逐渐消退直至变成单色的绿色荧光。结论 QDs对光漂白的抵抗能力强,比Cy5荧光染料具有更高的光稳定性,更加适用于细胞内蛋白质的长时间动态监测的研究。

Ⅵ型胶原肌膜选择性缺失型Ullrich型先天性肌营养不良临床及免疫病理特点

目的探讨Ⅵ型胶原肌膜选择性缺失型Ullrich型先天性肌营养不良(Ullrich congenital muscular dystrophy,UCMD)的临床和免疫病理特点。方法收集2例Ⅵ型胶原肌膜选择性缺失型UCMD患者的临床资料,进行肌肉活体组织检查,标本行Ⅵ型胶原免疫荧光染色和Ⅵ型胶原/Ⅳ型胶原双重免疫荧光染色,对病理结果进行分析。结果新生儿肌张力低下、近端关节挛缩和远端关节弹性过度是Ⅵ型胶原肌膜选择性缺失型UCMD的临床特点。抗Ⅵ型胶原免疫荧光染色提示2例患者均为Ⅵ型胶原表达部分缺失。Ⅵ型胶原/Ⅳ型胶原双重免疫荧光染色可见肌膜Ⅵ型胶原表达选择性缺失。结论Ⅵ型胶原肌膜选择性缺失型UCMD以近端关节挛缩和远端关节弹性过度为临床特征,临床严重度和Ⅵ型胶原完全缺失者没有显著差异。双重免疫荧光染色提示Ⅵ型胶原在肌膜上表达选择性缺失是其免疫病理特点。

两种粒径量子点在人舌鳞癌细胞中双色荧光成像的应用研究

目的研究粒径655 nm和525 nm的两种量子点(quantum dots,QDs)对人舌癌Tca8113细胞内2种热休克蛋白(heat shock protein,HSP)进行特异性荧光标记的成像效果和稳定性,为今后的连续动态观察提供实验依据。方法利用QD655nm和QD525nm,对人舌癌Tca8113细胞内HSP90蛋白和HSP70蛋白进行特异性双重荧光标记,激光连续照射2 420 391 ms,在共聚焦显微镜下同时观测人舌癌Tca8113细胞内的HSP90蛋白和HSP70蛋白表达及分布,用软件Leica Confocal Software测量量子点QD655nm和QD525nm的荧光信号强度变化。结果激光共聚焦显微镜下可见人舌癌Tca8113细胞内HSP90蛋白和HSP70蛋白均有明显表达,分别表现为红色和绿色荧光,两种蛋白重叠处呈黄色荧光,在激光连续照射中,两种荧光有所衰减,其中QD655nm的荧光强度值下降相对较快、幅度相对较大。结论量子点荧光标记技术能同时对人舌鳞癌细胞中HSP90蛋白和HSP70蛋白进行双重标记,而且QD655nm与QD525nm都具有较强的光稳定性,均可用于蛋白的长时间动态监测,其中QD525nm的稳定性更好。

编码精子赤道段蛋白的质粒DNA免疫影响小鼠生育功能

目的探讨编码小鼠精子赤道段蛋白(mESP)的DNA疫苗的免疫避孕功能。方法构建pcDNA3.1/mESP真核表达质粒,表达mESP蛋白N-端片段。将纯化后的质粒直接肌肉注射免疫8只BALB/c雌性小鼠,以空载质粒pcDNA3.1免疫作为对照组。通过RT-PCR检测重组质粒在小鼠体内的表达情况。通过ELISA和双重免疫荧光技术,检测免疫后小鼠体内mESP抗体反应。通过交配实验研究DNA免疫对小鼠生育功能的影响。结果接种重组质粒小鼠的肌肉呈现mESP cDNA条带阳性,说明重组质粒在体内表达。DNA免疫小鼠体内产生了特异性的mESP抗体。DNA免疫小鼠产仔率无改变,平均产仔数低于对照组(P<0.05)。结论 DNA疫苗用于免疫避孕需进一步提高免疫效果。

双重染色免疫荧光法评价选择性IgA缺乏症的B细胞成熟度

选择性IgA缺乏症(SIgAD)的发病机理至今尚未十分明确。本研究力图探讨SIgAD患者B细胞分化受阻的阶段。5例患者血清IgA均少于5mg/dl。以RITC抗IgA荧光抗体和FITC抗IgD或IgM荧光抗体采用免疫荧光技术对患者外周血淋巴细胞进行双重染色。以正常成人作为对照测定B细胞的数量和表型。结果显示患者的IgA-B细胞百分数较成人低。大多数TgA-B细胞不同于成人,多同时表达表面IgM、IgD和IgA。这说明SIgAD患者的IgA-B细胞成熟受阻于分化的早期阶段。

免疫荧光双重标记结合激光共聚焦扫描显微镜观察Ⅰ型胶原和硫酸软骨素在人牙本质中的分布

目的 介绍牙本质在不完全脱矿下免疫荧光双标染色方法,研究Ⅰ型胶原和硫酸软骨素在人牙本质中的分布情况,以期进一步理解牙本质湿粘接的机制.方法 选取新鲜拔除的无龋第三磨牙8颗,制备30 μm厚的牙本质切片40张,用37％磷酸凝胶酸蚀15 s,应用免疫荧光双重标记方法和激光共聚焦扫描显微镜,观察硫酸软骨素经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（tosyl-phenylalanyl chloromethyl ketone,TPCK）处理的胰蛋白酶消化去除前后相对胶原纤维的分布位置.结果 硫酸软骨素分布于牙本质小管管腔以及管周牙本质,Ⅰ型胶原纤维在管间牙本质和管周牙本质均存在;经特异性酶处理去除硫酸软骨素后,荧光强度明显减弱甚至消失.结论 免疫荧光双重标记结合激光共聚焦扫描显微镜可以在牙本质不完全脱矿的情况下研究其内部有机成分的分布;硫酸软骨素分布于牙本质小管管腔及管周牙本质,Ⅰ型胶原纤维分布于管间牙本质和管周牙本质.

免疫荧光双重染色对临床结核性创面石蜡组织中泡沫细胞及结核分枝杆菌显示效果的比较分析

目的观察免疫荧光双重染色对临床结核性创面石蜡组织中泡沫细胞及结核分枝杆菌(MTB)的显示效果,并与3种常规染色方法进行比较。方法采用实验研究方法。2019年4月—2020年5月,厦门大学附属翔安医院烧伤整形与创面修复科收治10例符合入选标准的结核性创面患者(男女各5例,年龄28~77岁),取其扩大清创术中切取并于该院病理科保存的创面石蜡组织进行研究。将每例患者创面石蜡组织制成40张切片,分别进行苏木精-伊红(HE)染色、免疫组织化学染色、抗酸-免疫组织化学染色、免疫荧光双重染色,每种方法10张。计算4种染色方法切片剔除率;观察4种染色方法的创面肉芽肿组织识别检出情况并计数,观察4种染色方法的创面组织泡沫细胞识别检出情况;比较4种染色方法的创面肉芽肿组织及非肉芽肿组织中MTB检出情况;比较抗酸-免疫组织化学染色和免疫荧光双重染色的创面肉芽肿组织及非肉芽肿组织中泡沫细胞的亚型分型及其分布、MTB检出率,创面组织中泡沫细胞形态清晰度以及MTB与泡沫细胞的非特异性着色率和阳性反应丢失率。对数据行Fisher确切概率法检验、单因素方差分析、独立样本t检验、Wilcoxon符号秩检验。结果HE染色、免疫组织化学染色、抗酸-免疫组织化学染色、免疫荧光双重染色切片剔除率分别为3%(3/100)、1%(1/100)、6%(6/100)、2%(2/100),总体比较差异无统计学意义(P=0.26)。4种染色方法均能识别创面肉芽肿组织,肉芽肿结构数相近(F=1.284,P=0.28)。4种染色方法均能识别创面组织泡沫细胞,每张切片均检出。HE染色和免疫组织化学染色创面肉芽肿组织与非肉芽肿组织中均未见MTB;抗酸-免疫组织化学染色和免疫荧光双重染色均显示MTB在创面肉芽肿组织及非肉芽肿组织中均有分布,多数MTB分布于创面肉芽肿组织中。抗酸-免疫组织化学染色不能区分泡沫细胞是否吞噬MTB;免疫荧光双重染色显示吞噬了MTB的泡沫细胞多分布在创面肉芽肿组织中,未吞噬MTB的泡沫细胞多分布在创面非肉芽肿组织中。免疫荧光双重染色的创面肉芽肿组织及非肉芽肿组织MTB检出率分别为(89.00±0.08)%、(82.67±0.05)%,明显高于抗酸-免疫组织化学染色的(54.56±0.14)%、(44.44±0.13)%(t=-12.495、-7.961,P<0.01)。相较于抗酸-免疫组织化学染色,免疫荧光双重染色的创面组织泡沫细胞清晰度更佳(Z=-3.162,P<0.01)。免疫荧光双重染色的创面组织MTB与泡沫细胞非特异性着色率和阳性反应丢失率分别为(9.11±0.07)%、(9.22±0.07)%,明显低于抗酸-免疫组织化学染色的(20.67±0.06)%、(44.00±0.12)%(t=4.569、15.519,P<0.01)。结论相较于HE染色、免疫组织化学染色、抗酸-免疫组织化学染色,免疫荧光双重染色呈现图像清晰直观、操作简便,能够精确实现MTB与泡沫细胞在临床结核性创面石蜡组织中的共定位显像。

白萝卜提取物促胃动力作用中Cajal间质细胞与P物质的变化

目的探讨白萝卜提取物(raphanus sativus lextract,Ecr)通过Cajal间质细胞促胃肠动力作用机制。方法40只SD大鼠随机分为A(Ecr)组、B(0.9%氯化钠对照)组分别灌服等体积Ecr和0.9%氯化钠,1h后用双重免疫荧光组织化学标记的方法观察胃电起搏区Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)与P物质(SP)阳性神经及产物表达的变化。结果肌间神经丛中ICC与SP阳性神经呈网络样分布,二者紧密毗邻;肌间神经丛及肌层内与ICC结合的SP阳性神经产物表达明显增加(P<0.01)。结论白萝卜提取物的促胃肠动力作用可能与胃体ICC上结合的SP阳性神经产物表达增高有密切关系。

一种肠类器官样本快速石蜡块的制作方法

类器官于2009年由Sato等[1]首次报道,其能较好地模拟体内细胞三维生长的生理条件,目前已广泛应用于疾病的研究并成为最具前景的实验技术。肠道病理的药理学、毒理学或微生物研究中常采用人或小鼠肠道组织进行肠类器官培养[2]。肠类器官培养成为研究和治疗肠道疾病可行的方法[3],也是一种全新的消化道疾病体外研究模型。

磷酸化组蛋白H3--检测心肌细胞有丝分裂指数的可靠指标

目的采用磷酸化组蛋白H3鉴定心肌细胞有丝分裂,为研究心肌细胞增殖机制奠定形态学基础。方法对H9c2(2-1)大鼠心肌细胞进行培养,利用免疫荧光双重染色技术,用横纹肌肌动蛋白IgM单克隆抗体标记心肌细胞,用磷酸化组蛋白H3 IgG单克隆抗体标记有丝分裂的染色体,同时用Hochest 33342显示细胞核,荧光显微镜观察并摄片。结果心肌细胞胞质呈红色荧光,有丝分裂的染色体呈现不同形状的绿色荧光,胞核为蓝色。结论磷酸化组蛋白H3是观察和鉴别心肌细胞有丝分裂的可靠指标。

大鼠生后不同发育阶段心肌细胞有丝分裂指数检测

目的检测大鼠生后不同发育阶段心肌细胞的有丝分裂指数,为研究心肌细胞增殖机制奠定形态学基础。方法取大鼠生后不同发育阶段心肌组织行冰冻切片,采用免疫荧光双重染色方法,以横纹肌肌动蛋白单克隆抗体标记心肌细胞,以磷酸化组蛋白H3单克隆抗体标记有丝分裂的染色体,同时用Hochest33342显示细胞核,荧光显微镜观察并拍照。结果心肌细胞胞质呈红色荧光,有丝分裂的染色体呈现不同形状的绿色荧光,胞核为蓝色;大鼠生后零天心肌细胞有丝分裂指数(0.905±0.087%)是生后2w(0.372±0.094%)的2.4倍(P<0.01),4w至成年几乎为零。结论大鼠出生2w后心肌细胞逐渐丧失增殖能力,由增生性生长向肥大性生长转化。

大鼠延髓孤束核吻侧段内脑啡肽阳性终末与γ-氨基丁酸阳性神经元联系的形态学研究

目的观察大鼠孤束核吻侧段(rNTS)内脑啡肽阳性(ENK-ir)终末与γ-氨基丁酸(GABA-ir)阳性神经元之间的联系。方法免疫荧光双重标记技术,包埋前免疫组织化学方法染色结合免疫金颗粒标记的电镜双标技术。结果激光扫描共焦显微镜下可见rNTS内有大量的ENK-ir纤维和终末及散在的GABA-ir神经元。ENK-ir终末与GABA-ir神经元之间形成密切接触。在电镜下可见ENK-ir阳性产物主要定位于圆形清亮突触小泡及大颗粒囊泡表面。ENK-ir轴突终末与GABA-ir及阴性神经元胞体及树突之间形成对称性和非对称性的突触联系,以对称性突触为主。结论rNTS内的ENK-ir终末可能通过抑制或增强GABA能神经元活性,或直接抑制味觉感受神经元活性的方式,参与NTS内味觉信息的感受和调节。

糖尿病兔模型视网膜VEGF表达的定位研究

目的研究糖尿病兔动物模型血管内皮细胞生长因子(VEGF)在视网膜中的定位。方法应用四氧嘧啶制备糖尿病兔动物模型,采用免疫荧光、免疫荧光双重标记技术,分别以胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体、VEGF抗体为一抗;羊抗兔IgG-Cy3、马抗鼠IgG-FITC为二抗进行免疫荧光染色。结果在糖尿病兔动物模型视网膜中,GFAP与VEGF共同表达于视网膜Müller细胞。结论糖尿病兔模型中,视网膜Müller细胞通过表达VEGF发挥促进新生血管形成的作用。

血管内皮细胞PDHA1基因特异性敲除鼠构建及其表型功能鉴定

背景:PDHA1基因是有氧呼吸链中不可或缺的基因,血管内皮细胞的能量代谢与很多疾病有关。构建血管内皮细胞PDHA1基因敲除鼠,有助于研究能量代谢在血管内皮细胞相关疾病中的作用。目的:繁育血管内皮细胞PDHA1基因特异性敲除小鼠并进行表型鉴定。方法:将PDHA1^((iΔEC/iΔEC))小鼠与PDHA1^((iΔEC/-))小鼠进行合笼繁育,获得更多的PDHA1^((iΔEC/iΔEC))小鼠进行后续实验。利用PCR和琼脂糖凝胶电泳进行基因鉴定,然后利用RT-PCR和Western blot检测敲除PDHA1后与能量代谢相关基因的mRNA及蛋白表达,利用VE-Cadherin与PDHA1双重免疫荧光判断PDHA1基因条件性敲除后PDHA1蛋白表达变化。结果与结论:利用琼脂糖凝胶电泳实验成功检测出子代小鼠基因型,包括PDHA1^((iΔEC/iΔEC))15只和PDHA1^((iΔEC/-))2只小鼠;RT-PCR和Western Blot检测发现PDHA1在转录水平和翻译水平都发生了下降,参与糖酵解途径的HK2蛋白及mRNA表达上升,参与有氧磷酸化途径方向IDH蛋白及mRNA表达下降;VE-cadherin和PDHA1双重免疫荧光共染色检测到PDHA1的表达下降。

转录因子cbfa1在骨髓干细胞向成骨细胞分化过程中的表达

目的 通过观察转录因子cbfa1的表达方式 ,探讨骨髓干细胞向成骨细胞定向分化的机制。方法 在诱导小鼠骨髓干细胞向成骨细胞分化的过程中 ,以双重荧光免疫方法在细胞水平发现和定位转录因子cbfa1,并观察其表达方式。结果转录因子cbfa1在骨髓干细胞分化时于原代培养第 3天开始出现 ,并持续表达于成骨细胞成熟过程中 ,其表达特异性地定位于细胞核内。结论 转录因子cbfa1与成骨细胞分化密切相关 ;定位观察cbfa1的表达为进一步研究其调控机制建立了有利的方法。