菊花B病毒和番茄不孕病毒RT-RPA双重荧光实时检测体系的构建与性能评价

菊花B病毒(Chrysanthemum virus B, CVB)和番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus, TAV)是危害菊花的2种主要优势病毒。为构建一种同步检测CVB和TAV逆转录重组酶聚合酶恒温核酸扩增(Reverse transcriptionrecombinase polymerase amplification, RT-RPA)双重荧光实时检测方法,本研究以CVB和TAV编码外壳蛋白(coat protein, CP)基因保守区域作为靶标设计RIA引物和探针,CVB和TAV探针的5’端分别标记FAM和VIC荧光素,通过对商业化的RT-RPA试剂筛选,引物探针的组合筛选,扩增体系的优化和扩增条件的摸索试验,构建了一种可同时用于CVB和TAV检测的RT-RPA双重荧光实时检测方法。并对该体系进行优化,优化后RT-RPA双重荧光扩增体系中CVB和TAV的最优引物浓度为400 nmol/L,最优探针浓度分别为100 nmol/L和120 nmol/L;最适反应温度为39℃,最适反应时间为15 min。在此扩增体系和条件下,对CVB和TAV的检测敏感性均为1拷贝/μL;对烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、菊花矮化类病毒和褪绿斑驳类病毒核酸检测结果为阴性,对菊花B病毒、番茄不孕病毒核酸检测结果为阳性;对1.0×10^(4)拷贝/μL和10拷贝/μL的高、低两种浓度的质粒平行检测10次,检测荧光出现阳性扩增拐点所需的时间T变异系数均小于5%,重复性好。采用RTRPA和RT-qPCR方法同步对实验室留存的有症状的100株菊花进行核酸提取并检测,检出6例CVB病毒株和4例TAV病毒株,总符合率100%。因此,本研究建立了一种能同时检测CVB和TAV的快速、灵敏的RT-RPA双重荧光实时检测方法。