鱼类双重荧光标记研究——以中华倒刺鲃幼鱼为例

为探究盐酸四环素(TCH)和茜素红S(ARS)对中华倒刺鲃(Spinibarbus sinensis Bleeker)的影响及标记效果,丰富鱼类荧光标记模式,研究使用TCH(100—500 mg/L)和ARS(100—300 mg/L)对中华倒刺鲃幼鱼进行双重浸染荧光标记,实验共设置5个处理组和1个对照组,浸染时间均为24h。结果显示,经90d的养殖实验后,标记鱼的耳石(包括矢耳石和星耳石)、倒刺、鳍条和鳍棘均能检测到双重荧光标记环,且TCH产生的黄色荧光环比ARS产生的红色荧光环更接近骨质结构内部。较高浓度处理组的矢耳石(≥300 mg/L TCH和≥150 mg/L ARS)、星耳石(≥300 mg/L TCH和≥200 mg/L ARS)和倒刺(400—500 mg/L TCH和150—300 mg/L ARS)中均能检测到明显的标记环(n≥2),但所有处理组的侧线鳞和非侧线鳞的荧光标记不明显(0≤n≤1)。经200—500 mg/L TCH和150—300 mg/L ARS处理的鳍条,及经300—500 mg/L TCH和200—300 mg/L ARS处理的鳍棘中可以同时检测到明显的TCH和ARS的标记环(n≥2)。此外,在整个实验中各处理组标记鱼与对照组相比,在生长和存活率方面均无显著性差异(P>0.05)。结果表明,使用TCH和ARS双重标记中华倒刺鲃幼鱼是可行的。双重荧光标记方法在水生生物标记回捕实验及实验性生物学研究方面具有潜在的应用前景。

量子点联合Cy5双重荧光标记人舌鳞状细胞癌细胞蛋白质的应用研究

目的比较以量子点(quantum dots,QDs)与Cy5荧光染料对人舌鳞癌细胞株Tca8113细胞中热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)和survivin蛋白质进行双重免疫荧光标记时蛋白质的分布及荧光的稳定性。方法以QDs和Cy5荧光染料对Tca8113细胞内HSP70和survivin蛋白质进行双重免疫荧光标记,在激光共聚焦显微镜下同时观察Tca8113细胞内的HSP70和survivin蛋白质表达及分布。激光连续照射2 420 391 ms,用激光共聚焦显微镜自带软件Leica Confocal Software测量QDs和Cy5的荧光信号强度变化。结果激光共聚焦显微镜下可见Tca8113细胞内HSP70和survivin蛋白质均有明显表达,分别表现为绿色和红色荧光,其中两种蛋白质重叠处呈黄色荧光。激光连续照射2 420 391 ms,QDs标记的绿色荧光未见明显衰减,而Cy5荧光染料标记的红色荧光基本淬灭,随着Cy5荧光的淬灭,绿红黄三色通道下所见的红绿黄3种颜色的荧光也逐渐消退直至变成单色的绿色荧光。结论 QDs对光漂白的抵抗能力强,比Cy5荧光染料具有更高的光稳定性,更加适用于细胞内蛋白质的长时间动态监测的研究。

荧光双重标记Cx43在大鼠“足三里”表达的实验研究

目的:研究缝隙连接蛋白Cx43在大鼠“足三里”穴的表达及其与穴位、经络的可能关系。方法:20只健康成年SD大鼠随机分为非针刺组、针刺组,每组10只。应用荧光双重标记免疫组织化学方法和激光扫描共聚焦显微镜技术对成年大鼠皮肤肌肉组织的Cx43进行定位、定量分析。结果:皮肤肌肉组织中Cx43主要在表皮上皮细胞、皮下筋膜的肥大细胞中表达;非针刺组中穴位处Cx43的表达显著高于非经非穴处,两者相比有极显著性差异(P<0.01);穴位针刺后Cx43表达显著增加,与非针刺组中穴位比较有极显著性差异(P<0.01)。结论:电针可使“足三里”穴区皮肤及肌肉组织中的Cx43表达明显增加,缝隙连接蛋白及缝隙连接可能在经络活动中起重要作用。

脑组织双重免疫荧光标记方法介绍

应用光学技术对荧光标记的组织切片样品进行成像观察是生物学研究的常规手段。本文主要介绍如何制备用于荧光显微镜和激光共聚焦显微镜成像的脑组织石蜡切片免疫荧光双重标记技术。

激光共聚焦显微镜观察免疫荧光双重标记的前列腺癌内基质金属蛋白酶及其作用底物的表达

目的:探讨应用激光共聚焦显微镜观察免疫荧光双重标记的前列腺癌标本的可行性及优点。方法:应用激光扫描共聚焦显微镜同时检测前列腺癌中基质金属蛋白酶(MMPs)和其作用底物的表达情况。结果:在激光扫描共聚焦显微镜下,可以清晰地观察MMP-7和层粘连蛋白(LN)可共同表达于前列腺癌细胞及基质中的基底膜、血管平滑肌和神经纤维;MMP-9和Ⅳ型胶原的主要表达于细胞外基质中的基底膜。结论:结合应用激光扫描共聚焦显微镜和免疫荧光双重标记技术能对蛋白进行精确的定位研究。

微量核酸样品的双重限制性荧光标记技术

目的采用双重限制性荧光标记技术(doub le restriction fluorescent labeling,DRFL)标记微量核酸样品,提高基因芯片用于病原体检测的灵敏度。方法以限制性显示技术处理SARS-CoV核酸样品,分别采用传统限制性荧光标记技术(直接采用荧光标记的通用引物标记)和双重限制性荧光标记技术(荧光标记的通用引物和荧光标记的dNTP的双重荧光标记)标记,进一步在同等条件下与基因芯片进行杂交、清洗和芯片扫描检测。通过对杂交结果的分析,比较2种标记方法的标记效果。结果以DRFL方法标记SARS基因片段,其荧光强度均值比传统荧光标记方法提高了3.5835倍。结论DRFL技术有效地提高单位分子标记片段的荧光强度值,提高了检测的灵敏度,可用于微量病原体核酸样品的基因芯片检测。

微量核酸样品的双重限制性荧光标记技术(英文)

目的采用双重限制性荧光标记技术(double restriction fluorescent labeling,DRFL),标记微量核酸样品,探索提高基因芯片用于病原体检测的灵敏度。方法以限制性显示技术处理SARS-CoV核酸样品,分别采用传统限制性荧光标记技术(直接采用荧光标记的通用引物标记)和双重限制性荧光标记技术(荧光标记的通用引物和荧光标记的dNTP的双重荧光标记)进行处理,并进一步与基因芯片进行杂交,在同等条件下进行杂交、清洗和进行基因芯片的扫描检测。通过对杂交结果的分析,比较两种标记方法的标记效果。结果以DRFL方法标记SARS基因片段,其荧光强度均值提高了3.5835倍,但互相对应的每个探针之间的荧光信号提高程度存在差异。结论DRFL技术能有效地提高单位分子标记片段的荧光强度值,并进一步提高了检测的灵敏度,可用于微量病原体核酸样品的基因芯片检测。

两种粒径量子点在人舌鳞癌细胞中双色荧光成像的应用研究

目的研究粒径655 nm和525 nm的两种量子点(quantum dots,QDs)对人舌癌Tca8113细胞内2种热休克蛋白(heat shock protein,HSP)进行特异性荧光标记的成像效果和稳定性,为今后的连续动态观察提供实验依据。方法利用QD655nm和QD525nm,对人舌癌Tca8113细胞内HSP90蛋白和HSP70蛋白进行特异性双重荧光标记,激光连续照射2 420 391 ms,在共聚焦显微镜下同时观测人舌癌Tca8113细胞内的HSP90蛋白和HSP70蛋白表达及分布,用软件Leica Confocal Software测量量子点QD655nm和QD525nm的荧光信号强度变化。结果激光共聚焦显微镜下可见人舌癌Tca8113细胞内HSP90蛋白和HSP70蛋白均有明显表达,分别表现为红色和绿色荧光,两种蛋白重叠处呈黄色荧光,在激光连续照射中,两种荧光有所衰减,其中QD655nm的荧光强度值下降相对较快、幅度相对较大。结论量子点荧光标记技术能同时对人舌鳞癌细胞中HSP90蛋白和HSP70蛋白进行双重标记,而且QD655nm与QD525nm都具有较强的光稳定性,均可用于蛋白的长时间动态监测,其中QD525nm的稳定性更好。

免疫荧光双重标记结合激光共聚焦扫描显微镜观察Ⅰ型胶原和硫酸软骨素在人牙本质中的分布

目的 介绍牙本质在不完全脱矿下免疫荧光双标染色方法,研究Ⅰ型胶原和硫酸软骨素在人牙本质中的分布情况,以期进一步理解牙本质湿粘接的机制.方法 选取新鲜拔除的无龋第三磨牙8颗,制备30 μm厚的牙本质切片40张,用37％磷酸凝胶酸蚀15 s,应用免疫荧光双重标记方法和激光共聚焦扫描显微镜,观察硫酸软骨素经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（tosyl-phenylalanyl chloromethyl ketone,TPCK）处理的胰蛋白酶消化去除前后相对胶原纤维的分布位置.结果 硫酸软骨素分布于牙本质小管管腔以及管周牙本质,Ⅰ型胶原纤维在管间牙本质和管周牙本质均存在;经特异性酶处理去除硫酸软骨素后,荧光强度明显减弱甚至消失.结论 免疫荧光双重标记结合激光共聚焦扫描显微镜可以在牙本质不完全脱矿的情况下研究其内部有机成分的分布;硫酸软骨素分布于牙本质小管管腔及管周牙本质,Ⅰ型胶原纤维分布于管间牙本质和管周牙本质.

含P物质的脊神经节细胞周围突的躯体—内脏分支投射

本文用荧光素双重标记与免疫细胞化学相结合的方法(三重标记法),证实具有躯体一内脏分支投射的脊神经节细胞的化学性质.首先,将2％FB水溶液注入大鼠左侧腹腔神经节,2天后将2％NY水溶液注入左侧第9～11肋间神经.第4天将动物灌注固定,取左侧Th9～11脊神经节恒冷箱切片,荧光显微镜下观察,可见3种细胞:①FB单标细胞;②NY单标细胞;③FB/NY双标细胞。双标细胞占全部标记细胞的8.5％.然后将有双重标记细胞的切片用P物质抗血清进行免疫细胞化学PAP染色,光镜观察.将PAP染色的切片与荧光素标记的同一张切片的照片进行对照,发现在上述3种标记细胞中,均有一部分被SP免疫反应所标记.其中FB/NY/SP三重标记细胞占FB/NY标记细胞数的28.8％.本文的结果不仅进一步证实了在脊神经节水平躯体一内脏感觉的“汇聚”,而且首次阐明了这些具有分支投射的脊神经节细胞含有P物质,为牵涉性痛和躯体-内脏反射的机制提供了新的化学神经解剖学依据.

大鼠延髓孤束核吻侧段内脑啡肽阳性终末与γ-氨基丁酸阳性神经元联系的形态学研究

目的观察大鼠孤束核吻侧段(rNTS)内脑啡肽阳性(ENK-ir)终末与γ-氨基丁酸(GABA-ir)阳性神经元之间的联系。方法免疫荧光双重标记技术,包埋前免疫组织化学方法染色结合免疫金颗粒标记的电镜双标技术。结果激光扫描共焦显微镜下可见rNTS内有大量的ENK-ir纤维和终末及散在的GABA-ir神经元。ENK-ir终末与GABA-ir神经元之间形成密切接触。在电镜下可见ENK-ir阳性产物主要定位于圆形清亮突触小泡及大颗粒囊泡表面。ENK-ir轴突终末与GABA-ir及阴性神经元胞体及树突之间形成对称性和非对称性的突触联系,以对称性突触为主。结论rNTS内的ENK-ir终末可能通过抑制或增强GABA能神经元活性,或直接抑制味觉感受神经元活性的方式,参与NTS内味觉信息的感受和调节。

糖尿病兔模型视网膜VEGF表达的定位研究

目的研究糖尿病兔动物模型血管内皮细胞生长因子(VEGF)在视网膜中的定位。方法应用四氧嘧啶制备糖尿病兔动物模型,采用免疫荧光、免疫荧光双重标记技术,分别以胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体、VEGF抗体为一抗;羊抗兔IgG-Cy3、马抗鼠IgG-FITC为二抗进行免疫荧光染色。结果在糖尿病兔动物模型视网膜中,GFAP与VEGF共同表达于视网膜Müller细胞。结论糖尿病兔模型中,视网膜Müller细胞通过表达VEGF发挥促进新生血管形成的作用。