大肠埃希菌ETT2毒力岛ECs3703基因和HPI毒力岛irp2基因双重LAMP检测方法的建立

根据GenBank中大肠埃希菌ETT2毒力岛保守基因ECs3703和HPI毒力岛的保守基因irp2分别设计一套LAMP引物,在同一体系中进行LAMP扩增,通过对体系Mg2+、dNTP、内引物及反应温度和反应时间等进行优化,建立了在60℃恒温下对大肠埃希菌ETT2和HPI毒力岛进行同步检测的LAMP方法,并进行了特异性和灵敏性试验。结果显示,所建立的双重LAMP检测方法同时检测ETT2和HPI毒力岛大肠埃希菌检测限均可达到100fg,比常规PCR灵敏度高100倍。利用该方法对8株非大肠埃希菌进行LAMP扩增,结果均为阴性。用该方法对采集的20份临床样品进行检测,与双重PCR检测结果一致。结果显示,该双重LAMP方法可用于大肠埃希菌ETT2和HPI毒力岛的同步快速检测,可作为临床疫病诊断的有效手段。

对虾白斑综合征病毒和传染性皮下及造血器官坏死病毒双重LAMP检测方法的建立和临床应用分析

为了快速有效地检测养殖对虾的对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV),建立了WSSV和IHHNV的双重环介导等温扩增(LAMP)检测方法,并以钙黄绿素荧光目测方法和电泳方法分别观察和检测结果。通过扩增序列分析发现,WSSV的LAMP扩增靶序列中存在HinfⅠ酶切位点,而IHHNV的LAMP扩增靶序列中没有此酶切位点,因此可以利用内切酶酶切反应来区分两种病毒的扩增产物。试验结果显示,所建立的双重LAMP方法具有较好的灵敏性和特异性。将所建立的检测方法进行临床应用,对湛江地区养殖场对虾WSSV和IHHNV的流行情况进行调查,结果发现,湛江地区养殖场WSSV和IHHNV感染率较高,且在低日龄虾苗中有感染情况。本研究所建立的LAMP方法不需要严格的仪器设备,反应快速、操作简单,适用于口岸检疫和条件相对落后的基层实验室进行疫病的快速检测。

创伤弧菌和副溶血弧菌双重LAMP检测方法的建立及初步应用

为建立创伤弧菌和副溶血弧菌的双重环介导等温扩增（loop—mediated isothermal amplification，LAMP）检测方法，本试验以创伤弧菌metalloprotease基因和副溶血弧菌ompA基因为靶点设计LAMP扩增引物，并在内引物间添加不同的酶切位点，通过对反应时间和温度的优化及酶切反应，成功建立了双重LAMP检测方法，并对其检测特异性、灵敏度和实际应用性进行了研究。结果显示，62℃反应45min时可同时检测到2种弧菌的存在，通过限制性内切酶酶切，可准确区分2种弧菌。该方法比普通PCR检测方法灵敏度高10^2～10^3倍。选择17株细菌菌株作为检测模板，发现除创伤弧菌和副溶血弧菌反应结果呈阳性外，其他均为阴性。以大菱鲆作为实验动物，检测双重LAMP技术的实际应用可能，该方法可准确检测并鉴定出组织和血液中感染的细菌种类，其灵敏度可达374～410CFU／g（mL）。SYBR Green Ⅰ是一种结合于DNA双链小沟中的荧光染料，反应产物加入该染料后，极易用肉眼判别。本试验成功建立了创伤弧菌和副溶血弧菌的双重LAMP检测方法，该方法可用于水产养殖中病原菌的早期诊断。

副猪嗜血杆菌与猪链球菌2型双重LAMP检测方法的建立

根据副猪嗜血杆菌的infB基因和猪链球菌2型的Cps2j基因各设计1套LAMP引物，在同一体系中进行双重LAMP扩增，采用琼脂糖凝胶电泳和SYBRGreenⅠ荧光检测，并对双重LAMP扩增产物进行熔解曲线的分析，建立了副猪嗜血杆菌与猪链球菌2型双重LAMP检测方法并进行了特异性和灵敏度试验。结果显示，该方法的灵敏度比常规PCR高两个数量级。通过熔解曲线特征峰的分析可以判断感染的确切目标菌株，且与其他的病原菌无交叉反应。对29份临床样品检测的结果显示，普通PCR和双重LAMP的检出率分别为17．0％和31．0％。结果表明，该方法具有良好的灵敏度和特异性，可实现两种病原的同步快速检测，对于临床疫病的初筛有一定的帮助。