应用双重PCR技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的：探讨双重聚合酶链反应(PCR)技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的临床价值。方法：临床分离得葡萄球菌，挑取单个菌落，用碱煮沸法制备DNA模板，进行双重PCR反应，即在同一反应管内同时扩增femA基因和mecA基因。结果：100株葡萄球菌中，38株凝固酶阳性的葡萄球菌，其femA基因均为阳性，而mecA基因阳性者为30株，占78．9％(30／38)，mecA基因阴性8株，占21．1％(8／38)。62株凝固酶阴性的葡萄球菌femA基因均为阴性，mecA基因阳性48株，占77．4％(48／62)，mecA基因阴性14株，占22．6％(14／62)。另外，药敏法中有4株临界水平MSSA经PCR法鉴定为MRSA。结论：应用双重PCR技术检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是一种敏感、快速、特异的实验诊断方法，可防止药敏法临界水平MRSA漏检为MSSA。

副溶血性弧菌和溶藻弧菌的双重PCR检测技术

主要针对副溶血性弧菌（VpBJ1997）和溶藻弧菌（VaATCC17749）的gyrB基因的不同位点设计特异性引物，利用双重PCR技术同时检测Vp（BJ1997）和Va（ATCC17749），并对该反应体系的特异性以及灵敏度进行检测。结果显示Vp（BJ1997）灵敏度的检测下限可达2×10^2CFU／mL，Va（ATCC17749）灵敏度的检测下限可达2．03×10^2CFU／mL，双重PCR与单一PCR检测的灵敏度的数量级是相同的；与沙门氏菌（ATCC27892）、金黄色葡萄球菌（ATCC13565）、大肠杆菌（35218）、河弧菌（H265）、鳗弧菌（M936）、创伤弧菌（ATCC27562）无交叉反应；在人工污染试验中，混合菌液的检测下限2．84×10^3CFU／mL，而进一步稀释至2．84×10^2CFU／mL时，Vp（BJ1997）已检测不出，Va（ATCC17749）仍可检出。研究表明，该方法特异性强，灵敏度高，操作简单，成本低，检测速度快，为基层单位同时检测副溶血性弧菌和溶藻弧菌提供了一种快速准确的方法，对控制水产品中这两种致病性弧菌具有重大的意义。

双重抑制PCR技术分离鹅微卫星标记

用双重抑制PCR技术分离11对鹅的特异微卫星引物,应用于浙东白鹅和太湖鹅的基因组PCR扩增。结果表明:11对引物在浙东白鹅和太湖鹅中分别扩增出37和36个清晰条带,20个等位基因为两品种所共有,11对引物中有5对呈中等多态、6对呈高度多态。各位点产生2～6个等位基因,各位点的平均杂合度为0.456～0.772,以G07位点为最高,G06位点为最低;平均多态信息为0.375～0.737,以G07位点为最高,G01、G03和G11位点为最低。浙东白鹅和太湖鹅有效等位基因数分别为2.655和2.558,与实际测得的两品种平均值3.364和3.273较接近。研究结果表明,两品种的等位基因分布较为均匀,与鹅的实际品种特征一致,因此,双重抑制PCR技术适合于鹅的基因组结构研究。

利用双重抑制PCR技术分离鸭微卫星标记

用双重抑制PCR技术分离10对鸭的特异微卫星引物，应用于北京鸭、樱桃谷鸭、高邮鸭3个品种的基因组PCR扩增。结果表明：10对引物中有7对引物具有多态，3对呈高度多态，4对呈中度多态。7对引物在上述3个鸭品种中分别扩增出23、22、23个等位基因，其中15个等位基因为3个品种所共有；各位点产生4～7个等位基因，平均杂合度为0．494～0．650，平均多态信息含量为0．414～0．586，平均有效等位基因数为2．001～2．870。3个鸭品种的平均杂合度分别为0．578、0．566、0．594，平均多态信息含量分别为0．496、0．480、0．524；平均有效等位基因数分别为2．441、2．340、2．615，与实测平均等位基因数3．286、3．1z12、3．286较接近。

双重TaqMan荧光定量PCR在β-地中海贫血产前诊断中的应用

目的建立基因点突变双重TaqMan荧光定量PCR方法,实现β-地中海贫血(β-地贫)高风险胎儿产前基因诊断快速、准确。方法以每反应管检测一个位点的突变和野生型基因序列,建立β-地贫基因点突变双重TaqMan荧光定量PCR体系,检测β-地贫高风险胎儿绒毛标本6例、羊水标本32例,根据荧光PCR阳性扩增结果结合两荧光通道的Ct值差异分析受检标本的基因型,同时以常规RDB检测为对照,分析与评价检测结果。结果 6例胎儿绒毛标本中,RDB检测无法判断结果 1例,经该方法检测为野合纯合子;RDB检测误诊为CD41-42合并CD26双重杂合子1例,经该方法检测为CD41-42杂合子。32例胎儿羊水标本中,RDB检测无法判断的标本1例,经该方法检测为CD41-42杂合子。该3例标本经重新采集胎儿羊水标本复查,验证了定量检测结果的准确性。结论β基因点突变双重TaqMan荧光PCR定量检测方法,可实现β-地贫高风险胎儿的快速准确产前基因诊断,操作简单快速,结果准确可靠,是较为理想的β-地贫产前诊断方法。

利用SSR标记鉴定西瓜杂交种纯度的研究

建立快速、准确、稳定的种子纯度检测技术是保证西瓜杂交种质量的有效措施。利用分子标记技术对小型西瓜‘美月’杂交种纯度进行鉴定。从均匀分布于不同西瓜染色体上的88对SSR引物中筛选出8对引物在‘美月’亲本间表现明显的多态性,分别位于第1、2、3、6、8、9、10染色体上,多态性比率为9.09%,多态性标记均为共显性标记。为了提高检测效率,结合多态性片段大小,同时对标记SSR48和SSR62进行扩增,可成功获得221 bp和131 bp的两组特异性条带,成功建立了双重PCR体系。为了提高鉴定结果的准确性,选用位于西瓜不同染色体上的4对共显性标记对‘美月’进行纯度检测,4对标记的检测结果高度一致,‘美月’杂交种纯度为99.44%。标记鉴定结果与田间表型鉴定结果比较分析表明,2种鉴定结果高度一致。研究结果可为西瓜杂交品种纯度快速检测和品种权保护提供理论依据与技术支撑。

侵染三七的三七Y病毒和中国番茄黄化曲叶病毒PCR同步检测技术

目的 建立一种高效、快速、准确地同步检测侵染三七Panax notoginseng的2种病毒——三七Y病毒(Panax notoginseng virus Y,Pn VY)和中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)的双重PCR技术。方法 分别以单一感染Pn VY或TYLCCNV及复合侵染了这2种病毒的染病三七植株为样品,CTAB法提取叶片总核酸作为模板,根据Gen Bank上已登录的Pn VY和TYLCCNV这2种病毒核酸序列设计特异性检测引物。通过单一PCR技术明确染病三七样品Pn VY和TYLCCNV的发生情况,筛选出可用于一步法双重PCR检测Pn VY和TYLCCNV的引物组合及引物浓度,并对反应条件进行优化。对扩增产物进行克隆测序,验证一步法双重PCR检测的准确性和特异性。结果 建立的一步法双重PCR检测技术能同步有效地检测三七病样中的Pn VY和TYLCCNV,检测灵敏度高,最低检测限点为核酸原液的0.01稀释倍数,特异性强。结论 所建立的一步法双重PCR检测技术可以高效、快速、准确、特异地同步检测三七样品中的Pn VY、TYLCCNV 2种病毒。

幽门螺杆菌TaqMan MGB探针双重荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立用于幽门螺杆菌快速定量检测和分型的TaqMan MGB探针双重荧光定量PCR方法。方法采用Primer Premier 5软件分析设计引物和探针,采用双重荧光定量PCR扩增幽门螺杆菌CagA和VacA基因片段,建立循环数与拷贝数关系的标准曲线。检测临床标本中所含幽门螺杆菌的循环数,用该方法对临床胃黏膜标本进行检测并与标准曲线对比,计算所含幽门螺杆菌的拷贝数。结果建立的TaqMan MGB双重荧光定量PCR方法检测幽门螺杆菌质粒的线性范围是10~2~10~8拷贝/μl,CagA和VacA基因标准曲线的相关系数分别是0.977 8和0.990 4。29份临床胃黏膜标本的CagA和VacA基因循环数Ct值分别在29~35和30~35之间,幽门螺杆菌拷贝数分别在1.0×10^(1.39)~1.0×10^(3.87)和1.0×10^(3.06)~1.0×10^(3.91)之间,且临床标本中的幽门螺杆菌均为I型。结论建立的TaqMan MGB双重荧光定量PCR法具有敏感、精确、快速的特点,可用于幽门螺杆菌的快速定量检测与分型鉴定。