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猪圆环病毒2型和3型双重PCR方法的建立及在藏猪猪圆环病毒检测中的应用 被引量:1
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作者 朱家平 肖琦 +6 位作者 钱雯娴 赵霞玲 张冯禧 尹力鸿 温立斌 索朗斯珠 何孔旺 《江苏农业科学》 北大核心 2022年第3期172-177,共6页
为同时并快速检测和鉴别猪圆环病毒2型(PCV-2)与猪圆环病毒3型(PCV-3),并调查西藏林芝地区猪圆环病毒的感染情况,根据笔者所在实验室PCV-2和PCV-3单重PCR方法,建立检测PCV-2和PCV-2双重PCR的方法,构建标准质粒并经优化反应条件和反应体... 为同时并快速检测和鉴别猪圆环病毒2型(PCV-2)与猪圆环病毒3型(PCV-3),并调查西藏林芝地区猪圆环病毒的感染情况,根据笔者所在实验室PCV-2和PCV-3单重PCR方法,建立检测PCV-2和PCV-2双重PCR的方法,构建标准质粒并经优化反应条件和反应体系后进行特异性和灵敏性的测定,并对西藏林芝周边地区藏猪粪便进行检测。结果显示,建立的PCV-2和PCV-3双重PCR检测方法对PCV1、CSFV、PRRSV、PRV、PPV、PEDV等常见猪源病原的检测结果均为阴性;并且建立的PCV-2和PCV-3双重PCR的灵敏度与PCV-2和PCV-3单一PCR的灵敏度一致,均能达到10^(1)拷贝数/μL;利用建立好的双重PCR方法对西藏藏猪临床样品进行检测,PCV-2、PCV-3的阳性率分别为38.3%(18/47)、12.8%(6/47),混合感染率为10.6%(5/47),与单一PCR的符合度为100%。由此可见,本研究建立的PCR方法方便、特异、准确,并有很高的敏感度,适于临床样品的检测,为PCV-2与PCV-3的诊断和防控提供理论依据。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 猪圆环病毒3型 双重pcr方法 藏猪 临床应用
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副猪嗜血杆菌和猪传染性胸膜肺炎放线杆菌双重PCR检测方法的建立及应用 被引量:2
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作者 余远迪 曾泽 +1 位作者 岳华 张斌 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第12期29-33,共5页
针对副猪嗜血杆菌(Hps)16SrRNA序列和猪传染性胸膜放线杆菌(App)ApxIVA基因序列各设计一对引物,分别能扩增大小为822bp和346bp的目的基因片段,建立快速鉴定Hps和App的双重PCR方法。特异性试验表明,该方法对波氏杆菌、巴氏杆菌、大肠埃... 针对副猪嗜血杆菌(Hps)16SrRNA序列和猪传染性胸膜放线杆菌(App)ApxIVA基因序列各设计一对引物,分别能扩增大小为822bp和346bp的目的基因片段,建立快速鉴定Hps和App的双重PCR方法。特异性试验表明,该方法对波氏杆菌、巴氏杆菌、大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、猪圆环病毒2型、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒的扩增结果均为阴性。敏感性试验表明,该方法与单项PCR的敏感性一致,最低可检测核酸浓度Hps 38pg/mL,App 3.8pg/mL;最低检测细菌含量Hps 8.9cfu,App 26.9cfu。利用该方法检测Hps和App参考菌株、临床分离株、36份临床肺组织样本和人工感染的猪肺组织样本。结果显示,该方法对参考菌株和临床分离株全部检出,36份临床样本中检出Hps 18份,App为阴性,与单项PCR检测结果一致,人工感染组织样本也均能检出。表明该方法适用于Hps和App的临床快速检测。 展开更多
关键词 副猪嗜血杆菌 猪传染性胸膜放线杆菌 双重pcr方法
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兔源F型多杀性巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立 被引量:5
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作者 王锦祥 孙世坤 +3 位作者 陈岩峰 陈冬金 桑雷 谢喜平 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期501-505,共5页
【目的】建立检测兔源F型多杀性巴氏杆菌的双重PCR检测方法,为兔巴氏杆菌病的诊断提供技术支持。【方法】根据多杀性巴氏杆菌kmt1基因和F型多杀性巴氏杆菌fcbD基因的保守序列分别设计了2对引物进行双重PCR扩增,对双重PCR检测方法的退火... 【目的】建立检测兔源F型多杀性巴氏杆菌的双重PCR检测方法,为兔巴氏杆菌病的诊断提供技术支持。【方法】根据多杀性巴氏杆菌kmt1基因和F型多杀性巴氏杆菌fcbD基因的保守序列分别设计了2对引物进行双重PCR扩增,对双重PCR检测方法的退火温度和混合引物浓度进行优化,并对方法的特异性、敏感性、重复性和准确性进行验证。【结果】该双重PCR方法最优反应条件为:退火温度60℃、混合引物浓度0.8μmol·L^(−1)。该双重PCR方法能扩增出兔源F型多杀性巴氏杆菌的kmt1基因片段(260 bp)和fcbD基因片段(490 bp)、兔源A和D型多杀性巴氏杆菌的kmt1基因片段(260 bp),对兔源支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和阴性对照均为阴性,无交叉反应,特异性较强。该方法对兔源F型多杀性巴氏杆菌的最低检出限为1×10^(3)拷贝·μL^(−1),敏感性高。应用该方法对90份病死兔肺脏样品进行批内和批间重复性试验,结果均一致,重复性好。应用该双重PCR方法和已报道的多重PCR方法同时检测87份已知结果的呼吸道病死兔肺脏样品,结果显示双重PCR方法检测结果和已报道的多重PCR方法检测结果与已知结果的符合率分别为97.70%和94.25%,双重PCR方法检测结果与已报道的多重PCR方法检测结果的符合率为93.10%,双重PCR方法的准确性更高。【结论】针对多杀性巴氏杆菌kmt1基因和F型多杀性巴氏杆菌fcbD基因建立的双重PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和准确性,为兔源F型多杀性巴氏杆菌的快速检测提供了技术支撑。 展开更多
关键词 F型多杀性巴氏杆菌 kmt1基因 fcbD基因 双重pcr检测方法
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兔源强毒力金黄色葡萄球菌双重PCR检测方法的建立 被引量:3
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作者 王锦祥 孙世坤 +3 位作者 陈岩锋 陈冬金 桑雷 谢喜平 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期857-862,共6页
【目的】建立检测兔源强毒力金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的双重PCR检测方法,为兔葡萄球菌病的诊断提供技术支持。【方法】根据兔源金黄色葡萄球菌的nuc和pvl两种毒力基因的保守序列分别设计了两对特异性引物进行双重PCR扩增... 【目的】建立检测兔源强毒力金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的双重PCR检测方法,为兔葡萄球菌病的诊断提供技术支持。【方法】根据兔源金黄色葡萄球菌的nuc和pvl两种毒力基因的保守序列分别设计了两对特异性引物进行双重PCR扩增,对双重PCR反应体系的混合引物浓度和退火温度进行优化,对双重PCR检测方法的特异性、敏感性和准确性进行验证。【结果】当双重PCR反应体系混合引物的浓度为0.6μmol·L^-1、退火温度为59.6℃时,双重PCR的扩增效果最优。该双重PCR检测方法特异性好,能扩增出兔源强毒力金黄色葡萄球菌的nuc(320 bp)和pvl(585 bp)基因片段以及低毒力菌株的nuc(320 bp)基因片段,对兔源多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌等4种常见兔源细菌性病原菌以及阴性对照均无交叉反应。该方法敏感性高,能分别检出10 pg和100 fg的强毒力和低毒力兔源金黄色葡萄球菌基因组DNA。该方法重复性好,批内和批间重复性试验的变异系数均为0;该方法准确性好,对119份临床样品的检测结果与已报道的检测金黄色葡萄球菌nuc和pvl基因的单重PCR检测方法的符合率为100%。【结论】针对nuc和pvl两种毒力基因建立的双重PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和准确性,为兔源强毒力金黄色葡萄球菌的检测提供了有效的技术支持。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌 强毒力菌株 低毒力菌株 双重pcr检测方法
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鼠疫一体系双重荧光定量PCR检测方法的建立及评价 被引量:3
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作者 董珊珊 段存娟 +4 位作者 郭英 石丽媛 钟佑宏 李伟 王鹏 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2019年第5期38-43,共6页
本研究根据鼠疫耶尔森氏菌caf1及YPO0392基因,设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,构建一体系的检测体系,对其敏感性、特异性和稳定性进行评价,并对8份鼠疫阳性及24份阴性DNA样本进行应用评价。结果显示,一体系双重检测鼠... 本研究根据鼠疫耶尔森氏菌caf1及YPO0392基因,设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,构建一体系的检测体系,对其敏感性、特异性和稳定性进行评价,并对8份鼠疫阳性及24份阴性DNA样本进行应用评价。结果显示,一体系双重检测鼠疫DNA的敏感度为17.93×10^-5 ng/μL;19份鼠疫菌DNA都有扩增,25份非鼠疫菌DNA都未扩增;对8份阳性现场DNA样本进行检测,一体系检测结果均为阳性;对24份阴性DNA样本进行检测,结果均为阴性。结果表明,本研究成功建立了可同时检测鼠疫耶尔森氏菌caf1和YPO0392基因的一体系双重荧光定量PCR方法,具有良好的敏感性与特异性,操作方便并节约成本,能够代替单基因检测方法。 展开更多
关键词 鼠疫耶尔森氏菌 caf1 TPO0392 双重荧光定量pcr方法
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鸡传染性喉气管炎和新城疫病毒双重PCR检测方法的建立 被引量:1
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作者 戴娜桑 《中国畜禽种业》 2020年第12期190-191,共2页
为了构建鸡传染性喉气管炎病毒(Avian Infectious Laryngotracheitis, AILT)和鸡新城疫病毒(Newcastle disease, ND)双重检测方法,本文以鸡传染性喉气管炎病毒和鸡新城疫病毒的基因保守序列为基础,进行2对特异性引物及2条非一致荧光基... 为了构建鸡传染性喉气管炎病毒(Avian Infectious Laryngotracheitis, AILT)和鸡新城疫病毒(Newcastle disease, ND)双重检测方法,本文以鸡传染性喉气管炎病毒和鸡新城疫病毒的基因保守序列为基础,进行2对特异性引物及2条非一致荧光基团标记的TaqMan探针设计与试验。优化、调整反应条件后,建立鸡传染性喉气管炎病毒和鸡新城疫病毒双重PCR检测方法。这种双重PCR检测方法对传染性喉气管炎病毒和鸡新城疫病毒监测灵敏度为10拷贝/L,相对于常规OCR检测方法灵敏度提高100倍,并且该PCR检测方法对禽流感病毒、鸡白血病病毒等检测结果均为阴性,具备良好的特异性,此外该检测方法批内和批间的重复变异系数都<2%。使用鸡传染性喉气管炎病毒和鸡新城疫病毒双重PCR检测方法对比常规的检验方法测试150份组织样品,达到100%的正确率,该方法可以作为鸡传染性喉气管炎病毒和鸡新城疫病毒的快速检测手段。 展开更多
关键词 鸡传染性喉气管炎病毒 鸡新城疫病毒 双重pcr检测方法 建立 试验
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猪圆环病毒2型和3型双重PCR鉴别检测方法的建立及应用 被引量:7
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作者 杨永宁 任宜家 申禄昌 《畜牧与兽医》 北大核心 2018年第12期91-95,共5页
为建立一种鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV-3)和3型(PCV-3)的方法,本研究根据GenBank中PCV-2、PCV-3基因序列分别设计合成特异性检测引物,经过双重PCR反应条件的优化,建立了鉴别检测PCV-2和PCV-3的双重PCR方法。该方法对PCV-2、PCV-3、PCV-2... 为建立一种鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV-3)和3型(PCV-3)的方法,本研究根据GenBank中PCV-2、PCV-3基因序列分别设计合成特异性检测引物,经过双重PCR反应条件的优化,建立了鉴别检测PCV-2和PCV-3的双重PCR方法。该方法对PCV-2、PCV-3、PCV-2/PCV-3混合物可分别扩增出300 bp、518 bp、300 bp和518 bp的特异性条带,检测PRV、PPV、PRRSV、CSFV、TGEV、PEDV均为阴性,对PCV-2/PCV-3混合物的检测灵敏度达2.1 ng DNA,与PCV-2和PCV-3单项PCR方法的符合率均为100%。该方法在检测136份临床病料样品的应用中,PCV-2阳性率达23.53%(32/136),PCV-3阳性率达18.38%(25/136),PCV-2/PCV-3混合感染率达7.35%(10/136),说明青海省部分地区猪群中存在PCV-2、PCV-3的流行,且存在PCV-2和PCV-3的混合感染。表明该双重PCR具有良好的特异性、敏感性、重复性、准确性和临床适用性,可以用于临床病料中PCV-2和PCV-3的快速低含量鉴别检测,将为PCV-2和PCV-3感染的临床鉴别诊断和流行病学监测提供了一种简便适用的方法,为我国猪圆环病毒病的综合防控提供技术支持。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 猪圆环病毒3型 双重pcr方法 应用
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猪伪狂犬病病毒野毒和猪圆环病毒3型双重PCR检测方法的建立 被引量:5
8
作者 赵宇 崔建涛 +4 位作者 田润博 韩昊莹 郑慧华 刘芳 陈红英 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期9-13,共5页
为了能够同时检测和鉴别猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)。本研究参考GenBank中公布的PRV gE基因和PCV3基因组序列,且基于PRV gE和PCV3 Rep基因的保守区域,利用Primer 5.0引物... 为了能够同时检测和鉴别猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)。本研究参考GenBank中公布的PRV gE基因和PCV3基因组序列,且基于PRV gE和PCV3 Rep基因的保守区域,利用Primer 5.0引物设计软件设计了2对特异性引物,随后对其扩增条件进行优化,建立了能够同时检测PRV和PCV3的双重PCR检测方法。该方法可以同时扩增PRV的429 bp和PCV3的344 bp特异性片段,而对猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒基因组扩增结果均为阴性。PRV和PCV3的最低检测值分别为502.0和91.2 copies/μL。结果表明该方法具有良好的特异性和灵敏性。本试验建立了能够同时快速检测PRV和PCV3,且具有高度特异性和灵敏性的双重PCR检测方法,为PRV和PCV3的检测提供技术支持。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病病毒 猪圆环病毒3型 双重pcr检测方法
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