牛支原体和丝状支原体丝状亚种双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病均为重要的牛传染病,两者均可致牛出现呼吸系统症状,临床上难以区分。为建立鉴别诊断牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病的双重Taq Man荧光定量PCR检测方法,本研究根据这两种病的病原丝状支原体丝状亚种和牛支原体的基因组保守区域(丝状支原体丝状亚种nt826-nt1742,牛支原体nt189-nt618)分别设计引物与探针,通过优化反应体系与反应条件,建立同时检测这两种病原的Taq Man荧光定量PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法仅对丝状支原体丝状亚种模拟样品和牛支原体检测结果为阳性,而巴氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、无乳支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种、丝状支原体山羊亚种、关节炎支原体Leachii株检测结果均为阴性,特异性较强。分别以1.0×10~7拷贝/μL~1.0×10~1拷贝/μL的p EASY-Mmm和p EASY-Mb质粒标准品为模板,进行敏感性试验,结果显示,该方法对丝状支原体丝状亚种和牛支原体重组质粒标准品的检测限均为1.0×10~1拷贝/μL,敏感性较高。对不同浓度质粒标准品混合物的重复性试验结果显示,组内与组间重复性试验变异系数均小于2.5%,重复性较好。利用该方法对112份临床样品(104份鼻拭子、8份肺组织样品)检测,结果显示,丝状支原体丝状亚种检测结果和已发表PCR方法检测结果一致,均为阴性,而本实验建立的方法检测出4份牛支原体阳性样品,且经测序证实检出样品为真实阳性样品,而已发表的多重PCR方法检测该病原结果均为阴性。本研究建立了能够同时检测丝状支原体丝状亚种和牛支原体的双重Taq Man荧光定量PCR方法,其特异性强、敏感性高、重复性好,可用于各种临床样品的检测,为这两种病原的快速检测和流行病学调查提供了技术手段。

犬瘟热病毒与犬冠状病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立鉴别检测犬瘟热病毒(CDV)和犬冠状病毒(CCoV)的方法,本研究采用PCR方法分别扩增CDV N基因和CCoV S基因,并克隆至pMD18-T载体中构建重组质粒pCDV-N、pCCoV-S,均经PCR和测序鉴定后测定浓度作为质粒标准品。同时针对CDV N基因和CCoV S基因设计特异性引物和TaqMan探针,采用方阵试验对各反应条件的优化,建立了同时检测这两种病毒的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。利用10倍倍比稀释的质粒标准品按照该方法检测,建立标准曲线,结果显示,两个重组质粒标准品均与各自的Ct值具有良好的线性关系。采用该方法分别检测CDV、CCoV、犬细小病毒、犬传染性喉气管炎病毒2型、犬副流感病毒,评估该方法的特异性;将两种质粒标准品分别10倍倍比稀释并等体积混合后,取108~101稀释度的质粒混合物作为模板,采用该方法检测,评估该方法的敏感性;将两种质粒标准品10倍倍比稀释并等体积混合后,分别取107、105、103稀释度的质粒标准品混合物采用该方法检测,评估该方法的重复性。结果显示,该方法仅能特异性扩增CDV和CCoV,与犬的其他病毒均无交叉反应,特异性较强;对CDV质粒标准品的检测限为5.0×103拷贝/μL,对CCoV质粒标准品的检测限为4.93×103拷贝/μL,敏感性较高;组内和组间的变异系数均小于3%,重复性较好。利用本实验建立的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法和已报道的CCoV RT-PCR及国标规定的CDV RT-PCR方法同时检测采集的100份临床腹泻犬样品,结果显示,共检出35份阳性样品,其中,CDV的阳性检出率为16%(16/100),CCoV的阳性检出率为19%(19/100),阴性样品65份,与CCoV和CDV参考方法的检测结果均一致。本研究建立的CDV和CCoV双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法可在40 min内完成检测,且准确、快速、敏感,为CDV和CCoV临床大量样品的快速和特异性鉴别检测提供了有效技术手段。

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究根据PRRSV GL膜蛋白基因和CSFV多聚蛋白基因,分别设计2对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果表明,该方法只对猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒特异性良好,不与非洲猪瘟、猪圆环病毒Ⅱ型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒等常发猪病存在交叉反应;PRRSV和CSFV的检出下限分别为1.41拷贝/μL和1.6拷贝/μL;组内和组间Ct值变异系数都小于1.3%。对175份临床采集的样品检测,PRRSV单一阳性样品27份,CSFV单一阳性样品16份,检测双阳性样品24份。本方法敏感高、特异强,可以用于猪场的快速检测与诊断。

幼虫芽孢杆菌和蜂房蜜蜂球菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为快速鉴别诊断蜜蜂美洲幼虫腐臭病(American foulbrood,AFB)和欧洲幼虫腐臭病(European foulbrood,EFB),本研究根据Gen Bank中登录的幼虫芽孢杆菌(Paenibacillus larvae)和蜂房蜜蜂球菌(Melissiciccus pluton)16S r RNA基因序列分别设计特异性引物和探针,建立了双重Taq Man荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法与其他病原无交叉反应;对P.larvae和M.pluton的检测灵敏度均达10 copies/μL的阳性质粒;重复性试验结果显示批内、批间变异系数均小于2%。应用该方法对200份实验室模拟样品和200份临床样品进行了检测,与预期结果一致。本研究建立的方法可用于AFB与EFB的快速鉴别诊断和早期监测,以及蜂产品中P.larvae和M.pluton的定量分析。

牛轮状病毒和牛冠状病毒双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种同时检测牛轮状病毒(BRV)和牛冠状病毒(BCV)的方法,本研究根据GenBank中登录的BRV VP6基因保守序列和BCV N基因保守序列设计引物和探针,通过方阵法优化体系后,建立了一种可以同时检测BRV和BCV的双重TaqMan荧光定量PCR方法。该方法与牛病毒性腹泻病毒、牛细小病毒、牛肠道病毒、牛传染性鼻气管炎病毒均无交叉反应,特异性强;敏感性试验结果显示,该方法对BRV和BCV重组质粒标准品的最低检测限分别为41.8拷贝/μL和3.55拷贝/μL,敏感性高;组内和组间变异系数均小于2%,表明该方法重复性较好。利用建立的该方法对本实验室于2019年3月~9月在河北省内采集的72份牛腹泻粪便样品进行检测,结果显示BRV的阳性率为50.0%(36/72),BCV的阳性率为75.0%(54/72),BRV和BCV共感染率为33.3%(24/72);而常规PCR的上述检测结果分别为47.2%(34/72)、70.8%(51/72),共感染率为29.1%(22/72),二者对BRV和BCV检测结果的阳性符合率分别为97.2%、96.8%,表明该方法可以用于临床样品的检测。本研究建立的双重TaqMan荧光定量PCR方法对BRV和BCV的检测和流行病学调查具有重要意义。

猪博卡病毒G1基因群和猪流行性腹泻病毒双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立同时快速定量检测猪博卡病毒(PBoV)G1基因群和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的方法,本研究参照GenBank登录的PBoV的NP1基因和PEDV的M基因保守序列,设计了引物和探针,经优化反应条件后,建立了能够同时检测PBoVG1基因群和PEDV的双重TaqMan荧光定量PCR方法。特异性试验结果显示该方法与PCV2、PRV、PDCoV、PRoV和TGEV无交叉反应,敏感性试验结果显示该方法对PBoV、PEDV的质粒标准品检测下限分别为21.8拷贝/μL和31.7拷贝/μL;且组内、组间变异系数均小于4%,重复性好。应用本实验建立的方法对2017年5月~2018年8月,河北省部分地区采集的142份仔猪腹泻样品检测结果显示,PBoVG1阳性率为18.3%(26/142),PEDV阳性率为62.7%(89/142),其中PBoVG1与PEDV共感染率为10.6%(15/142),该方法优于常规PCR方法。本研究建立的双重TaqMan荧光定量PCR方法对PBoV和PEDV的准确检测、病原监测、流行病学调查等均具有重要意义。

牛病毒性腹泻病毒内标双重TaqMan荧光RT-PCR方法的建立及初步应用

为建立牛病毒性腹泻病毒（BVDV）内标双重TaqMan荧光RT-PCR方法,本研究根据BVDV 5＇-UTR区序列设计引物和荧光标记探针,通过重叠延伸PCR（SOE-PCR）扩增获得内标模板,经体外转录得到可以作为内标物的cRNA。经反应条件的优化,建立了BVDV内标双重TaqMan荧光RT-PCR检测体系。结果表明：当cRNA浓度为103拷贝/μL时,二者均有较好的扩增曲线;该方法对I型BVDV的检测灵敏度为0.25 TCID50,对II型BVDV的检测灵敏度为2.5 TCID50;利用该方法对猪瘟病毒等其他相关核酸的检测结果均为阴性;重复性检测Ct值变异系数为0.54~4.73。对506份临床样品检测,结果有23份样品为阳性,阳性样品检出数量和编号与不含内标的单一荧光RT-PCR方法完全一致,表明该方法可以用来对BVDV进行准确、快速检测,并且可以对检测结果进行质量监控。

双重TaqMan荧光定量PCR在β-地中海贫血产前诊断中的应用

目的建立基因点突变双重TaqMan荧光定量PCR方法,实现β-地中海贫血(β-地贫)高风险胎儿产前基因诊断快速、准确。方法以每反应管检测一个位点的突变和野生型基因序列,建立β-地贫基因点突变双重TaqMan荧光定量PCR体系,检测β-地贫高风险胎儿绒毛标本6例、羊水标本32例,根据荧光PCR阳性扩增结果结合两荧光通道的Ct值差异分析受检标本的基因型,同时以常规RDB检测为对照,分析与评价检测结果。结果 6例胎儿绒毛标本中,RDB检测无法判断结果 1例,经该方法检测为野合纯合子;RDB检测误诊为CD41-42合并CD26双重杂合子1例,经该方法检测为CD41-42杂合子。32例胎儿羊水标本中,RDB检测无法判断的标本1例,经该方法检测为CD41-42杂合子。该3例标本经重新采集胎儿羊水标本复查,验证了定量检测结果的准确性。结论β基因点突变双重TaqMan荧光PCR定量检测方法,可实现β-地贫高风险胎儿的快速准确产前基因诊断,操作简单快速,结果准确可靠,是较为理想的β-地贫产前诊断方法。

同时检测多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

为建立可以同时检测多杀性巴氏杆菌(Pm)及其荚膜A型的快速敏感检测方法,本研究在建立的Pm kmt1基因的荧光定量PCR基础上,设计了该菌capA基因特异性引物和Taq Man探针,经优化反应条件建立了双重Taq Man荧光定量PCR检测方法。本实验从荚膜A型Pm C48-1菌株中扩增了capA基因,构建了重组质粒pMDcapA;以pMD-capA重组质粒为标准品,建立的标准曲线在9.83×10^(3)拷贝/μL~9.83×10^(9)拷贝/μL内与Ct值具有良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9873,扩增效率(E)为1.032。建立的双重荧光定量PCR方法可以同时检测Pm及其荚膜A型,而对B型、D型Pm、鸭疫里默氏杆菌、支气管败血波氏杆菌等细菌检测结果均为阴性,具有较强的特异性;对重组质粒标准品的检测灵敏度为10^(1)拷贝/μL,高于常规PCR检测方法(10^(3)拷贝/μL)100倍具有较高的敏感性;组内和组间重复性试验的变异系数均小于2%,具有较好的重复性。本实验建立的双重荧光定量PCR方法可以同时快速敏感地检测Pm及其荚膜A型,对于其临床和实验室的快速诊断具有重要意义。

基于非洲猪瘟病毒I177L和p72基因的双重TaqMan荧光定量PCR鉴别检测方法的建立

为建立一种可区分非洲猪瘟病毒(ASFV)野毒株和基因缺失疫苗株的荧光定量PCR方法,本研究根据ASFV HLJ/2018株(MK333180.1)I177L及p72基因序列,设计特异性引物及探针,经反应条件优化后建立一种双重Taq Man荧光定量PCR方法。绘制的标准曲线结果显示,两个重组质粒标准品p18T-I177L和p18T-p72相关系数R^(2)均在0.99以上,扩增效率E为88%~90%。表明两个重组质粒标准品的拷贝数均与各自的Ct值有良好的线性关系。特异性试验结果显示,该方法仅特异性扩增ASFV I177L和p72基因,对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)及猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对p18T-I177L和p18T-p72质粒标准品的检测下限分别为4.63×10^(2)拷贝/μL和4.09×10^(2)拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验结果显示,组内和组间重复性试验的变异系数均小于1.4%,重复效果好。分别利用该方法与ASFV荧光定量PCR检测试剂盒检测57份猪鼻拭子核酸样品,结果显示该方法检测出47份阳性核酸,10份阴性核酸样品。ASFV荧光定量试剂盒检测出46份阳性核酸,11份阴性核酸样品。二者的总符合率达94.7%,且二者的Kappa=0.825>0.75,P=1>0.05,表明两种方法无统计学差异且一致性良好。本研究建立的双重荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于ASFV的检测、鉴别检测和流行病学的调查研究。

PEDV和TGEV双重TaqMan荧光定量一步法RT-PCR检测方法的建立及应用

本文通过对猪腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)基因组生物信息学分析,分别在两种病毒基因保守区设计特异性探针和Real-Time PCR引物,并建立了检测PEDV和TGEV的双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,本研究建立的方法对其他常见病毒无交叉检出,具有较强的特异性;应用本方法对PEDV和TGEV检测灵敏度均可达101个拷贝。应用本法组装PEDV和TGEV双重实时荧光定量PCR试剂盒,该试剂盒批次内、批次间的变异系数CV(coefficient of variation,CV)分别低于0.58%和3.7%。应用该试剂盒对97份病例进行检测,阳性率提高了14.93%。本研究建立的一步法荧光定量RT-PCR方法具有快速、特异性好、灵敏度高、定量且重复性和稳定性好等优点,在PEDV和TGEV感染的快速鉴别诊断,以及流行病学调查方面都有广阔的应用前景。

超级细菌bla NDM-1和mcr-1基因双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立可同时检测超级细菌bla NDM-1基因和mcr-1基因的快速检测方法,针对bla NDM-1基因和mcr-1基因保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,以构建含有bla NDM-1基因和mcr-1基因片段的重组质粒作为阳性标准品,通过优化各种反应条件,建立同时检测bla NDM-1基因和mcr-1基因的双重荧光定量PCR方法。该方法能够特异性扩增bla NDM-1基因和mcr-1基因质粒标准品,而对照标准菌株的检测结果均为阴性。两种质粒标准品的检出下限均为1.63×101拷贝/μL,比常规PCR敏感性高100倍;组内和组间重复试验的变异系数均小于2%。应用所建立的方法对55株鸡源致病性沙门氏菌、10株生鲜畜禽产品源大肠杆菌临床分离株进行检测,未发现携带bla NDM-1基因和mcr-1基因的沙门氏菌分离株,发现2株携带bla NDM-1基因和1株携带mcr-1基因的大肠杆菌分离株。结果表明,本研究所建立的双重荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,为bla NDM-1基因和mcr-1基因的快速检测提供了有效的技术手段。

基因Ⅰ型和Ⅱ型牛病毒性腹泻病毒双重TaqMan荧光定量PCR的建立及应用

为对基因Ⅰ型和Ⅱ型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)进行鉴别检测,本研究根据GenBank中已登录的基因Ⅰ型和Ⅱ型BVDV 5'非编码区(5'-UTR)的参考序列,设计了一对BVDV Ⅰ型和Ⅱ型通用引物和2条鉴别探针,建立了Ⅰ型和Ⅱ型BVDV双重TaqMan荧光定量PCR检测方法,并利用该检测方法进行临床样品检测。特异性试验结果显示,除Ⅰ型和Ⅱ型BVDV外,该方法对猪瘟、牛传染性鼻气管炎、口蹄疫病毒等均无扩增曲线。敏感性试验结果显示,该方法对Ⅰ型BVDV检测下限为10拷贝/μL,Ⅱ型BVDV检测下限为100拷贝/μL,敏感性高。重复性试验结果显示,该方法组内和组间变异系数均小于1%。临床样品检测结果显示,Ⅰ型和Ⅱ型BVDV双重TaqMan荧光定量PCR检测方法可鉴别Ⅰ型和Ⅱ型BVDV,检测结果与OIE认可的BVDV普通PCR扩增产物测序结果一致。本研究所建立的Ⅰ型和Ⅱ型BVDV双重TaqMan荧光定量PCR具有快速、准确、可鉴别等优点,可用于Ⅰ型和Ⅱ型BVDV的快速鉴别检测。

猪PRRSV和PCV2双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为快速及定量的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2),本研究根据GenBank中登录的PRRSV和PCV2基因组确定了其基因保守序列,分别设计其特异性探针和引物,建立了PRRSV-PCV2双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。特异性试验显示该方法对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒及猪瘟病毒的检测结果均为阴性。对PRRSV和PCV2的检测灵敏度均达10拷贝/μl。重复性试验结果显示批内、批间变异系数均小于4%。应用该方法对60份已知临床病料进行检测,结果检出PRRSV和PCV2阳性感染率分别为30.67%和35%,混合感染率为11.67%,与已知结果的符合率为100%。该方法具有敏感、快速、特异、定量、重复性、稳定性好等优点,在用于PRRSV和PCV2感染的快速鉴别诊断的同时,在细胞培养特性以及疫苗生产检测中也具有广阔的应用前景。

犬腺病毒和犬细小病毒双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立犬腺病毒(CAV)和犬细小病毒(CPV)双重荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中已登录的CAV Hexon基因序列和CPV VP2基因序列,设计了2对特异性引物和2条Taq Man探针。经过条件优化建立了检测CAV和CPV的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示,以含有CAV Hexon基因和CPV VP2基因的重组质粒标准品为模板绘制标准曲线,其相关系数(R^2)均大于0.990,CAV和CPV荧光定量PCR均具有良好的线性关系。特异性试验结果显示,该方法仅对CAV-I型、CAV-II型和CPV检测结果为阳性,而对犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬冠状病毒检测结果均为阴性,表明其特异性强。该方法的敏感性检测结果显示其检测下限为10拷贝/μL。重复性试验结果显示该方法的组内和组间变异系数均小于2%,表明该方法重复性好。利用普通PCR方法与本实验建立的方法分别对感染CAV(10份)和CPV(27份)的犬模拟病料样品进行检测,两种方法对CAV和CPV检测的符合率分别可达100%和96.30%。本研究建立的荧光定量PCR检测方法具有快速、敏感、准确等优点,可以用于CAV和CPV的临床检测。

猪肺炎支原体和猪鼻支原体TaqMan双重荧光PCR检测方法的建立及应用

为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果表明,该方法特异性强,检测其他常见猪呼吸系统病原不发生交叉反应;对标准品pMD18-T-Mhp-183、pMD18-T-Mhr-P37的最低检测限分别达45.2 copies/μL和29.7 copies/μL,比普通PCR检测灵敏度提高10^(3)~10^(4)倍;该方法检测结果的批内与批间变异系数均小于2%。用该方法检测145份广西自治区内临床样品,从中检出82份Mhp和9份Mhr阳性样品。该方法可用于临床样品快速检测及实验室Mhp和Mhr的鉴定,可为Mhp和Mhr在猪群中的早期监测提供技术支持。

牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,建立的牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性、敏感性和重复性均良好。该方法BCoV重组质粒标准品在5.75×10^(7)~5.75×10^(3)copies/μL时与Ct值呈现良好线性关系,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型均无交叉反应,特异性良好;该方法对BCoV重组质粒标准品最低检测限为5.75×10^(1)copies/μL;批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于2%。利用所建立的TaqMan荧光定量PCR方法对收集的132份样品进行检测,与常规PCR相比,两者符合率为96.21%,可为BCoV的临床检测和流行病学调查提供技术支持。

鉴别猪圆环病毒2型和3型双重TaqMan MGB探针FQ-PCR检测方法研究

建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法,本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因,各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,经优化各反应条件和进行敏感性、特异性、重复性和干扰性试验,建立鉴别检测PCV2/PCV3的双重FQ-PCR方法。结果显示:该方法可特异性扩增PCV2、PCV3核酸,与猪伪狂犬病病毒(PRV)等8种病原及阴性对照无交叉反应,特异性较强;对PCV2和PCV3阳性质粒标准品的最低检出限均可达10 copies/μL,敏感性较高;PCV2/PCV3批内/批间重复试验变异系数(CV)值均在3%以下,表明方法稳定性、重复性较好;干扰性试验表明在两种病毒阳性质粒起始模板相差较大时该方法不会影响对其中任一病毒核酸的检出和准确定量。对42份临床疑似PCV感染样品检测结果与PCV2、PCV3基因测序结果符合率100%。本研究建立的双重FQ-PCR方法具有敏感性高达10 copies/μL、特异性强、在同一反应体系中能同时快速鉴别检测PCV2、PCV3等优点,可用于临床PCV2/PCV3感染的快速鉴别检测。

槟榔黄化植原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

槟榔是海南省重要的热带经济作物,由植原体侵染引起的槟榔黄化病(areca palm yellow leaf disease,YLD)是当前我国槟榔生产上的一种毁灭性病害。为了建立精准高效的槟榔黄化植原体检测方法,本研究基于槟榔黄化植原体16SrDNA基因,设计并合成特异性引物AMf/AMr和探针AM-Prode,使用该方法进行准确性、敏感性、特异性及重复性测试,并在其他植物的植原体病害进行检测。结果显示:本检测方法能够准确的检测出阳性样品,健康样品无扩增曲线;在敏感性测试中,该检测方法能检测到1.16×10^(1) copies/μL样本浓度水平,其标准曲线方程为y=-3.4185x+43.624,扩增效率为96.12%,相关系数R^(2)=0.9833;在特异性测试中,该检测方法对YLD的检测具有较好的特异性,槟榔、槟榔其他病害病原及其内生菌的基因组对本方法未造成干扰;在重复性测试中,该检测方法对槟榔黄化病的检测具有较好的重复性;并且该检测方法可对苦楝黄化病、细圆藤丛枝病及辣椒黄化病等8种植原体病害进行检测,对植原体的检测具有一定的通用性。本检测方法的建立,有利于为槟榔黄化病的精准诊断、病原监测及媒介昆虫的检测等研究提供可靠的技术手段。

猪细小病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

旨在建立一种猪细小病毒(PPV)快速准确PCR检测方法,根据PPV VP2基因的保守序列设计并合成1对特异性引物和1条特异性探针,建立了可检测PPV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。建立的检测方法敏感性高,最低可检测8.76×10^(1)copies/μL的PPV VP2基因标准品;特异性试验结果显示,该方法检测猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验组内与组间变异系数均低于2%,重复性良好。用该方法检测102份临床样本,检出阳性样本16份,阳性检出率为15.69%,将检测出的阳性样本进行PCR扩增并测序,证实检测样品中确实存在PPV。该方法敏感性高、特异性强,适用于PPV的定量检测及猪细小病毒病的流行病学调查。