利用CRISPR/Cas9系统编辑拟南芥2个双链结合蛋白

CRSPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行有效定点编辑,为获得基因缺失突变体提供了新的方向。本研究在双链结合蛋白(ds RNA-binding protein,DRB)DRB3和DRB5两个基因外显子的保守序列设计2个靶点,并构建与t RNA串联的双靶点CRISPR/Cas9表达载体。通过一次转化,获得了DRB3或DRB5单独被编辑或同时被编辑的拟南芥突变体dcl2drb4转基因T_1代植株,为研究DRB3、DRB5是否参与DCL4介导的抗病毒RNA沉默通路奠定基础。

CRISPR/Cas9系统编辑拟南芥dcl2drb4的双链结合蛋白7.1

为获得拟南芥dcl2drb4drb7.1三突变体,本研究构建基于CRISPR/Cas9系统靶标Drb7.1基因保守序列的重组质粒,并通过花粉管通道法转化拟南芥双突变体dcl2drb4。T_(1)代转基因植物Drb7.1扩增产物测序分析,发现有9个样品在Drb7.1第二个靶位点出现双峰,可能已发生编辑。对第13号转基因T_(1)代植株单克隆测序分析表明,在Drb7.1第二个靶位点分别插入了一个碱基(C或者A)。T_(2)代转基因植株测序分析表明,有9株植物为纯合的Drb7.1被编辑的dcl2drb4drb7.1突变体,为研究DRB7.1是否参与DCL4介导的抵御TCV病毒的RNA沉默信号通路提供了实验材料。

水稻双链RNA结合蛋白同源基因OsRBP的克隆及其表达的分析

在基因数据库中发现两个水稻EST片段与大白菜BcpLH基因的双链RNA结合结构域 (dsRBD)有同源的区域 ,根据同源片段的位置特征设计引物 ,用RT-RCR扩增粳稻 (Oryzasativasubsp .japonica)愈伤组织的cDNA ,得到大小为 1.8kb的DNA片段。该cDNA片段含完整的编码区 ,有两个典型的dsRBD ,分别与BcpLH的dsRBD在氨基酸水平上同源性为 75 %左右 ,故将其命名为OsRBP。RT -PCR表达分析显示该基因在未成熟的种子和愈伤组织中表达 ,在根、茎、叶、穗、成熟种子及胚芽鞘中没有表达信号 ,由此推测该基因的表达可能与种子和胚的早期发育相关。该研究首次从水稻中分离到双链RNA结合蛋白基因 ,并初步研究了其表达方式 。

番茄双链RNA绑定蛋白(SlDRB)基因家族鉴定及抗TYLCV防御反应分析

番茄生产是现代蔬菜生产的主导产业,因经济价值高,成为乡村振兴的优势产业。然而番茄生产大多面临番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)和其他病毒的严重威胁。最新研究发现双链RNA结合蛋白(DRB)在植物RNA干扰(RNAi)抗病毒通路中发挥重要作用。为探究番茄DRB(SlDRB)基因抗TYLCV防御反应,本研究通过生物信息学方法鉴定并分析番茄DRB基因的基础性质,包括DRB基因家族进化树、基因结构和基因染色体上的位置、保守基序、组织特异性表达等,同时利用实时荧光定量(qRT-PCR)技术检测SlDRB基因家族对TYLCV的防御反应。结果表明,番茄含有8个SlDRB基因家族成员,分布于6条染色体上,其中3个SlDRB基因位于1号染色体。番茄DRB家族可分出3个亚族,即DRB2/3、DRB6/7和DRB1/4/5/8,不同的亚族内含子数量和蛋白结构分布有所差异。亚细胞定位结果表明SlDRB1、SlDRB5、SlDRB6、SlDRB7和SlDRB8定位于胞外,SlDRB2和SlDRB3定位于细胞质,SlDRB4定位于细胞核。不同SlDRB基因的组织特异性表达差异明显,但是在叶片组织中大多数SlDRB基因表达相对适中,在根、花、果组织中多数基因表达水平相对较高。所有SlDRB基因在番茄受TYLCV侵染后表达水平均有升高,根据表达趋势分为四类:第一类基因SlDRB7、SlDRB8,表达水平持续上调;第二类基因SlDRB2、SlDRB3,在病毒接种第7天表达上调,在第14天下调;第三类基因SlDRB1、SlDRB4,仅在病毒侵染7 d表达上调;第四类基因SlDRB5、SlDRB6,仅在病毒侵染14 d表达上调。本研究在番茄上鉴定了8个SlDRB基因,并明确了该基因参与植株抗病毒的防御反应,为研究SlDRB在番茄RNAi抗病毒中的功能与作用奠定了基础。

Taq DNA聚合酶的分子改造及其在探针法qPCR直扩体系中的应用

Taq DNA聚合酶作为实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)技术的核心组分,其性能优劣直接影响qPCR技术的进一步发展。然而,野生型Taq DNA聚合酶的耐抑制剂性能差、延伸性能不足。为获得具有高性能的Taq DNA聚合酶,采用基因工程技术将双链DNA结合蛋白Sso7d或Sto7d融合在野生型Taq DNA聚合酶的N端或C端,构建了4个均可溶表达的改造体,再经过耐受性测试筛选较优的改造体,结果显示:改造体Taq-Sto的耐受性最高,其热稳定性不受影响,且在1 s/kbp的延伸条件下能成功扩增靶标,表明Taq-Sto具有增强的延伸性能,在TaqMan探针法qPCR体系中对腐殖酸、单宁酸、全血等抑制剂同样表现出良好的耐受性。EMSA实验发现:Taq-Sto对DNA模板的结合亲和力有所提高,有利于增强Taq-Sto对模板的竞争力;将Taq-Sto应用于非洲猪瘟病毒(ASFV)的TaqMan探针法qPCR检测,与商品化试剂相比,Taq-Sto具有更低的ASFV检出限,且在体积分数为2%~6%的猪粪便样本或猪肉样本中的检测灵敏度分别为100.0%和85.4%,说明Taq-Sto在直扩qPCR检测领域更具有优势。

ILF3蛋白家族生理及功能调节

ILF3蛋白家族是双链RNA结合蛋白中的一员，由位于人类19号染色体上ilf3基因编码，含有2个最主要的蛋白异构体，主要参与细胞周期调控和DNA损伤修复，参与脊椎动物RNA转录、RNA剪切、RNA编辑、RNA输出、亚细胞RNA定位等多水平方面的代谢，涉及细胞发育，细胞周期和病毒感染等多重细胞功能，调节血管内皮生长因子mRNA的稳定翻译。

小鼠双链RNA结合蛋白STAUFEN1介导的mRNA降解机制及其在脂肪细胞分化过程中的作用

过多能量摄入导致的肥胖已经成为了一个世界范围的问题,严重威胁着人们的健康。肥胖症以某些部位脂肪过度沉积为特点,而脂肪细胞的过度增殖和异常分化是肥胖发生的基础。越来越多的研究表明转录后调控在脂肪细胞分化过程中发挥着重要功能。STAU1(STAUFEN1)是一种双链RNA结合蛋白,能够靶向介导下游m RNA降解,参与脂肪细胞分化。STAU1可以在转录后水平调控脂肪细胞分化相关基因的可变剪接、翻译及降解,从而影响m RNA的代谢。该文就STAU1在脂肪细胞和组织中的功能和机制进行综述,希望为肥胖及2型糖尿病的治疗提供新的启示。

肥胖患者脂肪组织STAU1表达变化及其在脂肪间充质干细胞成脂分化中的作用

目的探讨双链RNA结合蛋白STAU1在肥胖患者脂肪组织中的表达变化,及其在人脂肪间充质干细胞(h ADSCs)成脂分化中的作用。方法选择56例慢性胆囊结石及疝气择期手术患者,根据BMI分为肥胖组27例和非肥胖组29例;术中取患者网膜及皮下脂肪组织,采用RT-qPCR及Western blotting法检测脂肪组织中的STAU1基因和蛋白,分析肥胖组患者网膜组织中STAU1基因与腰围、臀围、BMI、血压、血糖、血脂等指标的相关性。经网膜脂肪组织获取h ADSCs,分别于成脂诱导液处理0、2、4、6、8 d,油红O染色法检测细胞中甘油三酯生成情况(OD值),同法检测细胞中STAU1、过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPARγ)表达水平。将h ADSCs分为3组,干扰1、2组分别转染siRNA STAU1-homo-718、STAU1-homo-923,对照组不转染;转染2、4 d,同法检测甘油三酯生成情况及STAU1、PPARγ表达水平。结果肥胖组网膜脂肪组织中STAU1基因和蛋白表达水平高于非肥胖组(P均<0. 05),而皮下脂肪组织中STAU1基因表达差异无统计学意义;肥胖组网膜脂肪组织中STAU1基因表达水平与患者的腰围、臀围、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、空腹血糖无明显相关性,与BMI、甘油三酯呈正相关(r分别为0. 777、0. 795,P均<0. 01)。随着诱导分化天数增加,h ADSCs中甘油三酯生成增多,STAU1、PPARγ表达水平逐渐升高(P均<0. 05)。与对照组比较,干扰1、2组转染2、4 d时h ADSCs中STAU1表达降低,甘油三酯生成及PPARγ表达减少(P均<0. 05)。结论肥胖患者网膜脂肪组织中STAU1表达增加,且与BMI、甘油三酯呈正相关; STAU1可能通过上调PPARγ的表达,从而促进人网膜脂肪组织及h ADSCs成脂分化中甘油三酯的生成。

莱茵衣藻CrDRBs基因的克隆和生物信息学分析

双链核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)结合蛋白(double-stranded RNA-binding protein,DRB)是一类含有双链RNA结合结构域(dsRBD)的蛋白,在小核糖核酸(micro ribonucleic acid,microRNA或miRNA)的生物合成和作用方式选择方面起着重要作用.为获得莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii,C. reinhardtii)中所有CrDRBs的全长序列并进行生物信息学分析,从蛋白质功能结构域Pfam数据库中下载了dsRBD结构域模块,使用HMMER软件基于dsRBD检索C. reinhardtii全基因组序列,获得C. reinhardtii中4个含dsRBD结构域的CrDRB蛋白相关信息.抽提C. reinhardtii总RNA,反转录获得其cDNA,设计相应引物克隆获得其完整的基因ORF序列.设计实时荧光定量PCR引物,以actin基因为内参,分析C. reinhardtii各CrDRBs基因的相对表达.同源比对分析C. reinhardtii各CrDRBs蛋白的dsRBD序列.通过Phyre2软件在线预测其dsRBD的高级结构.将莱茵衣藻CrDRBs的dsRBD与拟南芥的5个DRB成员构建系统进化树分析,初步探讨分析莱茵衣藻CrDRBs各成员的的进化保守性.本研究共获得了4个莱茵衣藻双链RNA结合蛋白,均具有典型的dsRBD结构域,含有3个保守氨基酸.相比已报道的DUS16,其他3个CrDRBs的CDS序列较长,基因表达较高(除CrDRB2外).本研究为下一步揭示莱茵衣藻CrDRB在miRNA调控途径的功能奠定基础.

喉鳞状细胞癌中NF45表达及其对肿瘤细胞辐射敏感性的影响

目的探究双链RNA结合蛋白核因子(NF45)在喉鳞状细胞癌(LSCC)中的表达,及其对LSCC细胞辐射敏感性的影响及机制。方法实时反转录PCR(RT-qPCR)和免疫组化染色检测LSCC及癌旁组织内NF45表达。将NF45-shRNA慢病毒转染至Hep-2细胞,RT-qPCR和蛋白质印迹法(WB)测定细胞转染效果。将Hep-2细胞分为对照组、2 Gy组、sh-NC+2 Gy组和sh-NF45+2 Gy组,进行慢病毒感染和2 Gy X射线照射处理,CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞术测定细胞凋亡率。采用mCherry-EGFP-LC3B处理各组Hep-2细胞,免疫荧光染色检测细胞自噬水平,WB测定细胞内自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(LC3)-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1、p62蛋白表达水平。结果NF45在LSCC组织中的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.01)。感染NF45-shRNA的Hep-2细胞中NF45 mRNA相对表达量和蛋白相对表达量均显著低于对照组和sh-NC组(P值均<0.05)。与对照组比较,2 Gy组、sh-NC+2 Gy组及sh-NF45+2 Gy组细胞增殖活性均降低,细胞凋亡率增加,细胞内自噬溶酶体增多,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,Beclin-1蛋白相对表达量增加,p62蛋白相对表达量减少(P值均<0.05)。与2 Gy组比较,sh-NF45+2 Gy组细胞增殖活性降低且细胞凋亡率增加,同时,细胞内自噬溶酶体增多,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,Beclin-1蛋白相对表达量增加,p62蛋白相对表达量减少(P值均<0.05)。结论NF45在LSCC组织中表达升高,靶向下调NF45表达能够抑制LSCC细胞增殖活性,促进细胞凋亡,提高肿瘤细胞的辐射敏感性,该机制可能与调控细胞自噬水平有关。