基于光子爆发计数的双链DNA抗体均相分析方法研究

本文报道了一种基于共振散射光子爆发计数技术的双链DNA抗体(Anti-dsDNA antibody)分析新方法。基于金纳米粒子(Gold Nanoparticles, GNPs)极强的共振光散射性质,以GNPs为探针,通过激光强度、金纳米颗粒表面结合双链DNA数目、探针浓度、反应时间等实验条件的优化,建立了双链DNA抗体的均相免疫定量分析方法。最优实验条件下,该方法的线性范围为1.0×10^(-8)mol/L~1.0×10^(-7)mol/L,检测限为5.2×10^(-9)mol/L。与目前已有的方法相比,该方法具有快速、简单、灵敏度高和特异性好等优点,在临床诊断和生命科学中具有广阔的应用前景。

抗双链DNA抗体、抗核小体抗体、抗dsDNA-NcX抗体在系统性红斑狼疮中的研究进展

系统性红斑狼疮（SLE）是一种慢性、复发性、炎症性自身免性疾病，本病好发于育龄期女性，临床表现多样，且多种自身抗体的出现是SLE的重要特征。抗双链DNA抗体（抗ds—DNA抗体）是公认的与SLE病情活动相关的指标，是参与狼疮肾炎发病机制的一种自身抗体，其抗体效价随疾病的活动与缓解而降解，甚至可以转阴。

Taq DNA聚合酶的分子改造及其在探针法qPCR直扩体系中的应用

Taq DNA聚合酶作为实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)技术的核心组分,其性能优劣直接影响qPCR技术的进一步发展。然而,野生型Taq DNA聚合酶的耐抑制剂性能差、延伸性能不足。为获得具有高性能的Taq DNA聚合酶,采用基因工程技术将双链DNA结合蛋白Sso7d或Sto7d融合在野生型Taq DNA聚合酶的N端或C端,构建了4个均可溶表达的改造体,再经过耐受性测试筛选较优的改造体,结果显示:改造体Taq-Sto的耐受性最高,其热稳定性不受影响,且在1 s/kbp的延伸条件下能成功扩增靶标,表明Taq-Sto具有增强的延伸性能,在TaqMan探针法qPCR体系中对腐殖酸、单宁酸、全血等抑制剂同样表现出良好的耐受性。EMSA实验发现:Taq-Sto对DNA模板的结合亲和力有所提高,有利于增强Taq-Sto对模板的竞争力;将Taq-Sto应用于非洲猪瘟病毒(ASFV)的TaqMan探针法qPCR检测,与商品化试剂相比,Taq-Sto具有更低的ASFV检出限,且在体积分数为2%~6%的猪粪便样本或猪肉样本中的检测灵敏度分别为100.0%和85.4%,说明Taq-Sto在直扩qPCR检测领域更具有优势。

木犀草素对人胃癌细胞DNA双链断裂及同源重组修复的影响

目的探讨木犀草素对人胃癌细胞DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSBs)及同源重组(homologous recombination,HR)修复的影响。方法采用流式细胞仪检测作用木犀草素后各组细胞内ROS水平变化及GFP阳性率;彗星实验检测木犀草素对DSBs的影响;Western blotting检测DNA损伤标志性蛋白γH2AX和HR修复蛋白Rad51的表达;免疫荧光检测DNA损伤修复相关蛋白表达的募集情况。结果木犀草素以剂量依赖性方式增加胃癌细胞内ROS含量;用I-Scel质粒转染DR-GFP后木犀草素处理组GFP阳性细胞比例明显少于未加木犀草素组;但彗星实验表明,木犀草素处理后人胃癌AGS细胞后增加彗星尾炬;经木犀草素处理后,胃癌细胞中DNA的γH2AX上调,修复关键蛋白Rad51的表达下调;免疫荧光结果表明,在木犀草素处理人胃癌AGS细胞后HR修复蛋白Rad51在DNA损伤位点的募集减少。结论木犀草素能够促进人胃癌细胞DSBs,并抑制其HR修复。

抗dsDNA抗体阴性的系统性红斑狼疮患者抗Sm抗体、抗Rib⁃P抗体水平及临床意义

目的探讨抗Sm抗体、抗Rib-P抗体对抗双链DNA(dsDNA)抗体阴性的系统性红斑狼疮的诊断价值。方法选择2020年8月—2021年8月收治的抗dsDNA抗体阴性的系统性红斑狼疮68例作为研究组,同期72例非系统性红斑狼疮的自身免疫性疾病患者作为对照组,同期体检健康者78例作为健康组。采用化学发光法检测3组抗Sm抗体、抗Rib-P抗体,随后采用受试者工作特征(ROC)曲线分析抗Sm抗体、抗Rib-P抗体对抗dsDNA抗体阴性的系统性红斑狼疮的诊断价值,以及研究组抗Sm抗体、抗Rib-P抗体与临床表现、实验室指标的关系。结果研究组抗Sm抗体、抗Rib-P抗体阳性率均高于对照组、健康组(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,抗Sm抗体联合抗Rib-P抗体诊断抗dsDNA抗体阴性的系统性红斑狼疮的曲线下面积及敏感度均高于单一指标诊断。研究组抗Sm抗体、抗Rib-P抗体阳性者蛋白尿发生率及C3阳性率明显高于抗Sm抗体、抗Rib-P抗体阴性者(P<0.05)。结论抗Sm抗体、抗Rib-P抗体对抗dsDNA抗体阴性的系统性红斑狼疮具有一定的诊断价值,且二者联合诊断价值更佳,有望作为诊断抗dsDNA抗体阴性的系统性红斑狼疮的有效指标。

DNA聚合酶θ:易错的多功能DNA末端修复分子

DNA聚合酶θ(DNA polymerase theta,Polθ)是一种广泛存在于动植物中的DNA修复酶。它在选择性末端连接(alternative end-joining,Alt-EJ)途径中发挥着关键作用,常参与DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSB)损伤修复。在正常生理状态下,Polθ主要调控基因组稳定性。然而,在恶性肿瘤发生时,Polθ表现出异常高表达水平,并参与调控肿瘤细胞的恶性转变过程。研究表明,抑制Polθ活性可导致同源重组(homologous recombination,HR)缺陷的肿瘤细胞发生合成致死(synthetic lethality,SL)。因此,已经开发出多种针对Polθ的小分子抑制剂,可与其他化疗药物联合使用以抑制恶性肿瘤的发展。此外,敲除或抑制Polθ活性还能增加HR修复效率,从而提高外源基因靶向整合效果。本文综述了Polθ及其介导的Alt-EJ修复机制在生物学功能方面的最新研究进展,为靶向Polθ在肿瘤治疗和基因编辑方面的应用提供理论基础。

初诊系统性红斑狼疮抗双链DNA抗体表达对治疗效果的影响

目的 分析初诊系统性红斑狼疮患者抗双链DNA抗体表达对治疗效果的影响。方法 选取2013年1月至2021年6月该院风湿免疫科收治的115例初诊系统性红斑狼疮患者作为研究对象,按照抗双链DNA抗体表达与否分为抗双链DNA抗体阴性组(n=37)和抗双链DNA抗体阳性组(n=78),2组均规律使用激素联合环磷酰胺治疗,比较2组患者治疗第1、2、3、6个月疾病活动度评分,对比2组患者达标治疗率。结果 抗双链DNA抗体阴性组患者治疗第1个月达标治疗率为78.4%,第2个月达标治疗率为89.2%,第3个月达标治疗率为89.2%,第6个月达标治疗率为86.5%;抗双链DNA抗体阳性组患者治疗第1个月达标治疗率为48.7%,第2个月达标治疗率为75.6%,第3个月达标治疗率为83.3%,第6个月达标治疗率为80.8%。2组患者治疗第1、2、3个月达标治疗率比较,差异均有统计学意义(P<0.05);2组患者治疗第6个月达标治疗率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 抗双链DNA抗体对患者早期治疗方案的调整、提高系统性红斑狼疮总的达标治疗率具有一定提示意义;并建议在系统性红斑狼疮最初治疗的3个月内对抗双链DNA抗体阳性者应做到更加全面地评估,并延长随访时间,在达标治疗前尽可能减少器官损害,甚至降低死亡风险。

血清抗Jo-1抗体、抗dsDNA抗体与复发性流产的相关性

目的:检测复发性流产患者血清抗双链DNA抗体(dsDNA)、抗Jo-1抗体的表达并探究其与复发性流产关系。方法:选取2019年1月-2020年2月本院收治的复发性流产患者100例为复发性流产组,无不良孕产史且已正常生育的女性100例作为对照组。采用酶联免疫吸附法检测两组血清抗Jo-1抗体、抗dsDNA抗体及抗心磷脂抗体(ACA)表达水平及对复发性流产的诊断价值,logistic回归分析复发性流产发生的相关影响因素。结果:复发性流产组血清抗Jo-1抗体(23.0%)、抗dsDNA抗体(17.0%)、ACA阳性(22.0%)表达率均高于对照组(5.0%、4.0%、8.0%)(均P<0.05);复发性流产组中抗Jo-1抗体和抗dsDNA抗体联合检测阳性率较抗Jo-1抗体、抗dsDNA抗体、ACA单独检测及抗Jo-1抗体和ACA抗体联合检测和抗dsDNA抗体和ACA抗体联合检测阳性率高(P<0.05)。受试者工作特征曲线分析显示,抗Jo-1抗体、抗dsDNA抗体及二者联合诊断复发性流产的曲线下面积分别为0.590、0.570、0.660,敏感度分别为95.0%、97.0%、94.0%,特异度分别为23.0%、17.0%、38.0%。血清抗Jo-1抗体阳性表达、抗dsDNA抗体阳性表达、ACA阳性表达是影响复发性流产发生的独立危险因素。结论:复发性流产患者血清中抗Jo-1抗体、抗dsDNA抗体呈高表达,二者异常高表达是复发性流产发生的危险因素,可作为复发性流产的早期诊断生物学指标。

适配体筛选中单链DNA获取方法研究进展

适配体技术近20年来快速发展,在食品安全、环境监测、法医鉴定、生物医药等领域都得到了高度重视。目前,已有大量研究针对小分子、蛋白质、病毒、细菌、细胞等进行了单链脱氧核糖核酸(ssDNA)适配体筛选。然而ssDNA适配体筛选仍然是一项费时费力的工作,一般都需要经过10轮左右甚至更多轮的ssDNAdsDNA(双链DNA)-ssDNA重复步骤,直到亲和力强的序列成为主要序列,经过测序后,从中挑选一条或几条亲和力最强的序列。显然,在此过程中ssDNA的获取是适配体筛选的关键步骤,也是限速步骤。本文对适配体筛选研究中ssDNA获取的方法进行了系统综述,期望针对适配体筛选中ssDNA次级文库的获取环节可以展开更多更深入的研究,以提高筛选效率。

DNA双链断裂修复缺陷在神经退行性疾病发生中的作用

DNA双链断裂修复(DNA Double-Strand Break Repair,DSBR)在保持神经元基因组稳定性和细胞存活方面发挥着重要作用。DSBR主要通过同源重组(Homologous Recombination,HR)及非同源末端连接(Non-Homologous End Joining,NHEJ)来完成,这两种修复途径对于维持神经元的正常生理功能至关重要。另外,DSBR异常在多种神经退行性疾病中扮演重要角色,因此,深入剖析DSBR机制对于理解神经退行性疾病的病理发生及研发有效治疗手段具有重要意义。本文综述了常见的DSBR途径,并概述了DSBR异常与几种常见神经退行性疾病发病机制的最新研究进展。

基于机器学习方法对人类基因组DNA双链断裂位点进行识别

DNA双链断裂(double-strand break,DSB)是细胞中一种严重的DNA损伤形式,与包括癌症、重组异常、神经元发育异常在内的多种基因组不稳定性疾病密切相关。由于成本和技术门槛的限制,高通量测序技术绘制的高分辨率DSB图谱十分有限,这阻碍了我们对不同物种基因组中DSB情况的认知。据此,我们建立了以随机森林(RF)、支持向量机(SVM)和逻辑回归(LR)三种分类器为基础算法的分类预测模型,对人类上皮细胞基因组DSB位点进行预测。除了之前预测研究中常用到的表观特征和DNA形状特征外,我们发现DNA序列特征(k-mer频数、GC含量、GC-偏移和互信息)也能表征DSB位点。同时,在考虑DNA物理性质、化学位移和自相关信息后,预测结果得到有效提高。将上述所有特征合并后进行预测,得到了较好的分类预测结果,其中逻辑回归(LR)的分类预测性能是最佳(AUC=0.97),与以往的预测结果相当(AUC=0.964)。另外,通过特征递增搜索方法,得到由294个特征组成的最优特征集,对应的AUC值达到0.974。

甲基苯丙胺损伤神经系统双链DNA的作用研究

目的探讨甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)损伤不同类型神经细胞双链DNA的情况。方法体外实验,分别培养原代皮质神经元、HT-22细胞、BV2细胞、HMC3细胞和U-87 MG细胞,分别给予METH后,观察细胞形态和用Western blot检测各组细胞表达γ-H2AX的水平。体内实验,建立METH腹腔注射小鼠模型,应用旷场实验进行小鼠行为学分析。HE染色观察小鼠前额叶皮质和海马内神经细胞的形态变化,用IF观察两个脑区内双链DNA损伤情况,用Western blot检测两个脑区表达γ-H2AX的水平。结果体外实验,给予METH后,原代皮质神经元、HT-22细胞、BV2细胞、HMC3细胞和U-87 MG细胞形态发生明显变化,细胞突触变短或消失,胞体皱缩,间隙增宽。各组细胞表达γ-H2AX水平明显升高。体内实验,给予METH后,与生理盐水组相比,小鼠运动极其活跃,运动轨迹和路程明显增加。HE染色结果显示前额叶皮质和海马内神经元明显水肿,嗜酸性增强,部分神经元变性改变。IF结果显示,与生理盐水组相比,METH组前额叶皮质和海马内神经细胞发生双链DNA损伤的数量明显增多,且荧光强度明显增强。Western blot结果显示,与生理盐水组相比,METH组前额叶皮质和海马组织表达γ-H2AX水平明显升高。结论METH可损伤神经系统双链DNA。METH可诱导原代皮质神经元、HT-22细胞,BV2细胞、HMC3细胞和U-87 MG细胞以及小鼠前额叶皮质和海马组织表达γ-H2AX水平明显增高。该研究可为阐明METH诱导神经毒性作用机制提供理论依据。

化学发光法定量检测抗双链DNA IgG抗体的方法学性能验证

目的验证Maglumi2000 P化学发光免疫分析仪检测抗双链DNA IgG抗体(Anti‑dsDNA IgG)的性能。方法参考美国临床和实验室标准化协会(CLSI)的系列标准文件、中国合格评定国家认可委员会(CNAS)的相关应用说明和指南,以及Anti‑dsDNA IgG测定试剂盒说明书,制订定量检测Anti‑dsDNA IgG的性能验证方案。对Maglumi2000 P检测系统测定AntidsDNA IgG的精密度、准确度、检出限、线性范围和生物参考区间进行验证。结果Anti‑dsDNA IgG高、低水平的重复性精密度变异系数分别为3.70%、3.01%;中间精密度变异系数分别为5.13%、3.48%;回收率为94.09%;符合率为100%;检出限为0.500 IU/ml;线性范围为0.452~795.6 IU/ml;生物参考区间≤30 IU/ml。结论Maglumi2000 P化学发光免疫分析仪测定Anti‑dsDNA IgG的各项性能指标与厂家提供的基本一致,满足实验室要求,能够为系统性红斑狼疮等自身免疫病的诊断及治疗监测提供可靠依据。

心肌梗死PCI患者微血管阻塞和心功能与血清双链DNA水平的相关性

目的探讨血清双链脱氧核糖核酸(DNA)水平与心肌梗死经皮冠状动脉介入术(PCI)治疗患者微血管阻塞和心功能的相关性。方法选取行PCI治疗的90例心肌梗死患者为研究对象,入院时测量患者血清双链DNA水平,根据血清双链DNA水平的中位数分为高水平组(45例)和低水平组(45例)。随访2年,记录2组患者微血管阻塞发生情况,采用Kaplan-Meier生存曲线分析血清双链DNA水平与心肌梗死PCI患者微血管阻塞的发生风险,采用Pearson相关性系数分析血清双链DNA水平与心肌梗死PCI患者心功能的相关性。结果高水平组微血管阻塞发生率为55.56%(25/45),低水平组为24.44%(11/45)。高水平组发生微血管阻塞的风险高于低水平组(χ^(2)=4.014,P<0.05);Pearson显示血清双链DNA水平与舒张末期内径(LVEDD)、舒张末期左心室容积(LVEDV)、收缩末期左心室容积(LVESV)呈正相关,与左室射血分数(LVEF)、左心室搏出量(LVSV)水平呈负相关(P<0.05)。结论血清双链DNA水平升高与心肌梗死PCI患者微血管阻塞风险增加相关,且血清双链DNA水平越高心肌梗死PCI患者心功能越差。

血清中抗核抗体与抗双链DNA抗体联合检测对系统性红斑狼疮的诊断价值

目的:研究联合检测血清内抗核抗体(ANA)及抗双链DNA抗体对系统性红斑狼疮(SLE)的诊断价值。方法:选取2022年1月—2023年1月贵州省兴义市人民医院收治的SLE患者68例为试验组,同期在院进行检测的健康者68例为对照组。检测两组血清ANA以及血清抗双链DNA抗体,比较两组检测结果阳性率。结果:试验组的血清抗双链DNA抗体检测、血清ANA检测、血清抗双链DNA抗体+ANA检测阳性率均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。结论:联合检测血清中ANA、抗双链DNA抗体,对于诊断SLE有极高的应用价值。

川芎嗪通过RAD52调控乳腺癌细胞DNA损伤修复

目的:探究TMP对乳腺癌BT474细胞增殖、细胞周期及其调控蛋白表达与DNA双链断裂修复通路的相关性。方法:CCK8法测定TMP对乳腺癌BT474细胞的增殖抑制情况;流式细胞术测定TMP对细胞周期的影响;单细胞凝胶电泳测定分析TMP对损伤后细胞DSBs累积情况的影响;Isce-I内切酶系统检测TMP对修复通路活性的影响;Western blotting检测DSBs修复通路相关染色体结合蛋白表达水平变化。结果:TMP通过使细胞阻滞在G_(1)期呈浓度依赖性抑制BT474细胞增殖,显著减少体内由Zeocin导致的细胞拖尾DNA含量(P<0.05);TMP显著增加BT474细胞对RAD52、ERCC1、XRCC4以及DNA LigⅣ蛋白募集,减少对KU80蛋白募集,促进了SSA以及NHEJ通路修复活性(P<0.05)。结论:TMP通过阻滞BT474细胞停留在G_(1)期使其发挥增殖抑制作用的机制之一;TMP通过增强损伤缺口对各个通路的关键染色体结合蛋白募集,促进SSA与NHEJ修复通路活性从而减少DNA损伤。

肿瘤细胞诱导抗双链DNA自身抗体的产生及其生物学特性

为探讨肿瘤细胞是否能诱导anti dsDNA自身抗体的产生及其特性 ,将灭活的SP2 /0、Wehi 16 4、P815等肿瘤细胞免疫BALB/c小鼠 ,结果均产生了高滴度的anti dsDNA自身抗体。对肿瘤细胞诱导的anti dsDNA自身抗体结合特性的研究表明 ,其结合DNA不具有种属、序列、构象特异性。进一步用cELISA和间接免疫荧光法检测发现 ,anti dsDNA自身抗体还能结合多种肿瘤细胞 。

基于SYBR Green I的双链DNA定量方法

基于SYBR Green Ⅰ荧光染料与双链DNA（dsDNA）结合产生荧光的原理,建立一种高精度、高通量的双链DNA定量方法。将梯度稀释后的基因组DNA及已知浓度的λDNA与等体积的SYBR Green Ⅰ（4×）充分混合后,利用荧光定量PCR仪采集荧光信号,以ROX（1×）作为校正染料进行定量分析;同时利用紫外分光光度计对样品进行平行测定,比较该方法与紫外分光光度法的检测限与准确度。紫外分光光度法的检测限为2ng/μl,而SYBR Green Ⅰ荧光定量法的检测限可达到0.015ng/μl,并且在0.015-2ng/μl范围内,SYBR Green Ⅰ荧光强度与λDNA浓度呈线性关系（R2=0.9999）,比紫外分光光度法灵敏100倍以上,并可准确定量低纯度的DNA样品。此方法具有重复性好、高通量的特点,仅需少量的生物样本即可满足定量要求,为分子生物学研究及临床检验等多个领域提供了一种可靠的dsDNA定量方法。

γ射线诱导的肝癌细胞DNA双链断裂

为了揭示辐射生物学效应的机理，用倒转脉冲场凝胶电泳（ＰＩＧＥ）研究了γ射线辐照肝癌ＳＭＭＣ—７７２１细胞诱导的ＤＮＡ双链断裂（ＤＳＢ）及其修复２４、４８ｈ后的产额和片段的分布情况。结果表明：修复０ｈ和２４ｈ的样品，ＤＮＡ片段释放百分比（ＰＲ）随着剂量的增加而增加；诱导的ＤＳＢ片段主要是 １Ｍｂｐ— ２Ｍｂｐ的大片段； ＤＳＢ产额分别为 ０．３８ＤＳＢｓ／１００Ｍｂｐ· Ｇｙ和０．０６ＤＳＢｓ／１００Ｍｂｐ·Ｇｙ，即２４ｈ内，约８４％的ＤＳＢ发生了重接；修复４８ｈ后残余的ＤＳＢ片段与剂量无关，且与对照细胞的ＤＳＢ片段含量相近。可见，γ射线诱导的ＤＳＢ容易发生修复；未修复的ＤＳＢ将导致细胞的增殖死亡。

电离辐射诱导的DNA双链断裂

利用γ射线和不同LET的碳离子辐照小鼠B16黑色素瘤细胞、Hela细胞、V79中国仓鼠肺细胞和人肝癌SMMC -7721细胞的DNA ,采用脉冲场凝胶电泳结合荧光扫描技术研究了DNA双链断裂(DSB)片段的分布。结果发现DSB片段是非随机分布的 ,而且这种分布与DNA序列有关。原因可能在于沉积的能量直接或间接沿DNA链迁移 ,链上相对较弱的化学键优先产生反应 ,并最终导致链的断裂 ,从而引起断裂的不均匀分布。