肝炎病毒蛋白对双链RNA依赖性蛋白激酶的调节作用

乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)蛋白以及丁型肝炎病毒(HDV)基因组RNA与双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)之间可以进行特异性结合,使病毒感染的靶细胞对干扰素(IFN)的敏感性发生了改变。同时,肝炎病毒基因组及其编码产物与感染靶细胞中PKR分子之间的结合,将产生广泛的生物学效应。

双链RNA依赖的蛋白激酶在非小细胞肺癌预后预测及靶向治疗中的作用

【目的】探索双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)联合其他肿瘤代谢相关蛋白能否作为非小细胞肺癌(NSCLC)的更有效的预测因子;同时拟研究部分肿瘤代谢相关化合物,如胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)抑制剂、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂等与PKR表达的关系,拟求达到更好的靶向治疗及个体化治疗的目的。【方法】免疫组化检测212例NSCLC中PKR、IGF-1R表达情况,并用于Kaplan-Meier生存分析。Western Blotting检测13种肺癌细胞株PKR、p-PKR表达;磺基罗丹明B法(SRB)检测PPP、Rapamycin等药物作用后对高表达及低表达p-PKR细胞的抑制率。【结果】全组NSCLC患者中,PKRlow/IGF-1Rhigh患者的5年总生存率(21.6%)明显低于PKRhigh/IGF-1Rlow患者(74.6%)及其他患者(58.2%)(P<0.0001),单、多因素分析提示PKR/IGF-1R联合标记物为NSCLC患者总生存率的独立预后因素。SRB结果提示,第1～3天,IGF-1R抑制剂PPP 3μmol/L在6个肺癌细胞株中均能显著抑制细胞生长,在0.3μmol/L剂量低表达PKR和/或p-PKR的H1792和H292细胞株中,较其他细胞株更能抑制细胞生长。而mTOR抑制剂Rapamycin采用1、0.1及0.01μmol/L 3个剂量级在各细胞株均未见明显抑制细胞生长的区别。【结论】PKR联合IGF-1R可预测NSCLC的预后,PKR低表达的H1792、H292细胞株中,IGF-1R抑制剂PPP具有显著抑制作用,但对于mTOR抑制剂Rapamycin,未见明显作用,提示可通过检测PKR的表达来选择适合IGF-1R抑制剂PPP的病人。

抗病毒蛋白PKR的结构和功能

病毒感染后，细胞合成分泌大量的干扰素（In—terferon，IFN），这些IFN通过自分泌或旁分泌的方式与细胞膜上的受体结合。激活STAT／JAK信号级联反应，调控300多个干扰素调控基因（Interferonstimulatedgenes，ISGs）的转录翻译水平，其中包括经典的抗病毒蛋白PKR。PKR即双链RNA依赖性蛋白激酶，是一种丝／苏氨酸蛋白激酶。

NLRP3炎性小体与TLR3和PKR的关系及在动脉粥样硬化中的研究进展

动脉粥样硬化是心脑血管疾病发生的共同病理基础,动脉粥样硬化的形成与炎症反应关系密切。最近研究表明,天然免疫应答和获得性免疫应答参与动脉粥样硬化斑块的形成,进展和破裂,NLRP3炎性小体作为天然免疫的重要组分在机体免疫反应和动脉粥样硬化炎症反应中起着核心作用,且NLRP3炎性小体激活途径也基本阐明,目前发现Toll样受体和双链RNA依赖性蛋白激酶可能在NLRP3炎性小体信号通路中起着重要的作用。

慢性粒细胞白血病PKR基因的表达及临床意义

目的检测双链RNA依赖性蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR)基因在慢性粒细胞白血病(CML)病人及CML细胞株K562细胞中的表达情况。方法分离CML患者慢性期(CP)15例,加速期(AP)11例,急变期(BC)9例及11例正常供者骨髓或外周血单个核细胞,应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测其PKR基因表达情况,并同时检测PKR基因在K562细胞中的表达。结果正常对照组PKR表达阳性率为90.9%,高于加速期的81.8%(P<0.05)及急变期的77.8%(P<0.05);正常对照组PKR/GAPDH比值为(0.92±0.40)%,高于慢性期的(0.85±0.32)%(P<0.05)及加速期的(0.72±0.54)%(P<0.05),明显高于急变期的(0.46±0.31)%(P>0.01)。K562细胞PKR/GAPDH比值为(0.55±0.13)%。结论 CML细胞及K562细胞株都有一定丰度的蛋白激酶PKR基因表达,为通过激活PKR而靶向诱导CML细胞凋亡奠定理论基础。

Poly Ⅰ:C刺激对裸鼹鼠和小鼠巨噬细胞PKR/eIF2α信号通路影响的比较研究

目的比较研究聚肌胞苷酸(Poly Ⅰ:C)对裸鼹鼠和小鼠巨噬细胞双链RNA依赖性蛋白激酶R(PKR)/真核细胞翻译起始因子2α(EIF2α)信号通路的影响。方法分别提取裸鼹鼠和C57BL/6J小鼠巨噬细胞,随机分成对照组、Poly Ⅰ:C给药组、2-氨基嘌呤(2-AP)给药组、Poly Ⅰ:C+2-AP给药组。给药后,蛋白印迹检测细胞中磷酸化PKR(Pho-PKR)、PKR、磷酸化EIF2α(Pho-EIF2α)、EIF2α、Caspase-8蛋白的表达情况。结果 Poly Ⅰ:C给药后,小鼠巨噬细胞的PKR和e IF2α磷酸化水平显著降低(P<0.01),而裸鼹鼠相反则显著升高(P<0.01),表明Poly Ⅰ:C能抑制小鼠的PKR活性,而裸鼹鼠的PKR活性被显著激活;Poly Ⅰ:C干预的基础上通过2-AP抑制PKR活性,结果显示,2-AP给药后下调了小鼠和裸鼹鼠PKR和磷酸化PKR的表达(P<0.01),尤其是裸鼹鼠的PKR,2-AP给药后显著地抑制裸鼹鼠PKR的表达;单独2-AP给药后小鼠巨噬细胞的活性PKR和活性eIF2α比例显著下降(P<0.01),裸鼹鼠巨噬细胞的活性PKR比例也显著下降(P<0.01);通过2-AP抑制PKR活性后,裸鼹鼠细胞的Caspase-8蛋白表达水平显著下降,但小鼠细胞的表达却无显著差异。结论与小鼠比较,裸鼹鼠细胞对Poly Ⅰ:C刺激具有较高的抗性;细胞的PKR对2-AP的敏感性更强;PKR活性对Caspase-8表达有促进作用。

抑制脑PKR活性可增强记忆力

双链RNA依赖性蛋白激酶（PKR）最初作为一种病毒感染感受器而为人所知,但其在大脑中的作用至今仍然鲜见报道。Zhu等最近发表的论文报道称抑制脑PKR活性可增强记忆力。

miR-92a对心肌缺血再灌注小鼠损伤PKR/NLRP3的影响

目的研究miR-92a对心肌缺血再灌注小鼠损伤双链RNA依赖性蛋白激酶/炎性小体(PKR/NLRP3)的影响。方法60只C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组、阴性模型组及inhibitor模型组。对照组行假手术处理,模型组为结扎冠脉降支的IR模型小鼠,阴性模型组及inhibitor模型组小鼠分别通过静脉注射空载质粒和miR-92a inhibitor质粒后同样建立IR模型。建模成功后,检测小鼠心肌梗死面积、心脏射血分数(EF)、缩短分数(FS)以及血清炎症指标;RT-qPCR和Western blot检测PKR与NLRP3的mRNA及蛋白表达水平。结果与对照组比较,模型组、阴性模型组及inhibitor模型组小鼠LVEF及LVFS均显著降低(P<0.05),模型组与阴性模型组LVEF及LVFS水平差异无统计学意义(P>0.05),而inhibitor模型组小鼠LVEF及LVFS水平显著高于模型组及阴性模型组(P<0.05)。此外,模型组与阴性模型组心肌梗死百分比差异无统计学意义(P>0.05),inhibitor小鼠心肌梗死百分比显著低于模型组与阴性模型组(P<0.05)。与对照组比较,模型组、阴性模型组及inhibitor模型组小鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平均显著升高(P<0.05),模型组与阴性模型组血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平差异无统计学意义(P>0.05),而inhibitor模型组小鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平显著低于模型组及阴性模型组(P<0.05)。与对照组相比,模型组、阴性模型组及inhibitor模型组PKR、NLRP3 mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05),其中模型组与阴性模型组PKR、NLRP3 mRNA及蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),而inhibitor模型组PKR、NLRP3 mRNA及蛋白表达水平显著低于模型组与阴性模型组(P<0.05)。结论抑制miR-92a可能通过抑制PKR及NLRP3,减轻心肌缺血再灌注损伤小鼠心脏炎症反应,发挥心肌保护功能。

固有免疫调控蛋白PKR串联亲和纯化系统的建立及应用

目的构建固有免疫调控蛋白——双链RNA（dsRNA）调控的蛋白激酶（PKR）的串联亲和纯化系统（TAP），初步研究PKR蛋白功能，以用于与PKR相互作用的新蛋白的鉴定与功能分析。方法通过PCR扩增PKR目的基因，克隆至真核表达载体pcTAP—A中。将重组质粒pcTAP-PKR通过脂质体法转染PKR稳定沉默（PKRkd）的HeLa细胞，并检测PKR对固有免疫信号通路之一，即促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）激活的调控；最后利用串联亲和纯化试剂盒纯化分离与PKR相互作用的蛋白，验证PKR蛋白复合物的纯化情况。结果将重组质粒pcTAP-PKR转染PKRkd HeLa细胞后，24h后即可检测到PKR融合蛋白，相对分子质量约为75×10^3，其表达量随着转染时间的增加而减少；PKR的过表达可发生自我磷酸化，并引起了MAPK信号通路的激活；Westernblot结果显示，小规模TAP纯化试验成功分离纯化了PKR蛋白。结论成功建立了一个PKR表达和串联亲和纯化系统，并证明PKR具有调控MAPK信号通路活性，为今后鉴定与PKR相互作用的蛋白研究奠定了基础。