双链RNA依赖的蛋白激酶与阿尔茨海默病相关性研究进展

阿尔茨海默病(AD)是一种严重威胁人类健康的疾病,也是引起人类死亡的三大因素之一。双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)又称为前炎症细胞因子,是人类先天免疫干扰素刺激因子之一。在AD发生和发展中,PKR表达上调并持续激活,一方面引发脑组织细胞发生整合应激反应,另一方面间接上调β位淀粉样前体蛋白裂解酶1的表达,促进β淀粉样蛋白(Aβ)的积累,而Aβ的积累又可以激活PKR,进一步促进Aβ的积累,形成一个Aβ持续积累的循环。PKR还可以促进Tau蛋白磷酸化,降低神经细胞微管稳定性。脑组织炎症反应、Aβ的积累所引起神经毒性和微管稳定性的破坏会导致AD发生发展,引起患者记忆和认知的下降,因此PKR是AD发生发展中的关键分子。有效进行PKR检测可以预测AD进展,为临床治疗AD提供先机。目前PKR已成为研发治疗AD药物的靶点,因此靶向PKR的抑制剂有望控制PKR的活性,从而有效控制AD发生发展。

双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)的真核表达、纯化及鉴定

[目的]获得真核表达的Flag-PKR融合蛋白,以用于流感病毒相关的PKR信号通路调控机制研究。[方法]以RT-PCR方法扩增PKR目的基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.0-Flag中。将所构建的重组质粒pcDNA3.0-Flag-PKR转染293T细胞,利用Flag抗体偶联的琼脂糖凝胶(anti-Flag M2-Agarose)纯化Flag-PKR融合蛋白,所得产物进行SDS-PAGE、Western blot及体外活性鉴定。[结果]重组质粒转染293T细胞,Western blot显示表达出的融合蛋白能够被抗Flag的抗体特异性识别,其相对分子量约为69 kDa,与Flag-PKR融合蛋白大小相符;体外磷酸化试验表明,Flag-PKR融合蛋白能够发生自动磷酸化。[结论]在293T细胞中表达、纯化了有活性的Flag-PKR融合蛋白,为PKR信号通路的研究奠定了基础。

丙型肝炎病毒核心蛋白对双链RNA依赖蛋白激酶活性的影响

目的探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白对双链RNA依赖的蛋白激酶（PKR）活性的影响。方法将表达HCV核心蛋白的真核表达质粒pCMH6K—Core转染人肝癌细胞系BEL-7402，应用干扰素（IFN）。α-2b诱导内源性PKR的表达及活化，利用Western blot检测核心蛋白对PKR磷酸化的影响；将荧光素酶质粒pGL3-Promoter与不同剂量的pCMH6K—Core共转染BEL-7402细胞，进行荧光素酶活性检测，以反映核心蛋白对细胞蛋白合成的影响。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间均数比较用t检验或单因素方差分析。结果在IFNα-2b刺激下，表达HCV核心蛋白的BEL-7402细胞中，PKR的磷酸化水平明显低于空白质粒转染组和未转染组，而3组总PKR的表达水平无明显差别。在共转染荧光素酶质粒与核心蛋白表达质粒的BEL-7402细胞中，荧光素酶活性较共转染空白质粒组增强，且荧光素酶潘性的增高与核心蛋白的表达量呈剂量依赖效应，0．5μg、1．0μg和1．5μg的pCMH6K-Core转染组荧光素酶活性分别为空白质粒组的（1．941士0．199）倍、（2．868±0．275）倍和（3．839±0．338）倍，各组比较，P值均＜0．05。结论在人肝癌细胞系BEL-7402中，HCV核心蛋白能够抑制内源性PKR的活性，从而促进细胞蛋白合成。

双链RNA依赖的蛋白激酶在非小细胞肺癌预后预测及靶向治疗中的作用

【目的】探索双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)联合其他肿瘤代谢相关蛋白能否作为非小细胞肺癌(NSCLC)的更有效的预测因子;同时拟研究部分肿瘤代谢相关化合物,如胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)抑制剂、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂等与PKR表达的关系,拟求达到更好的靶向治疗及个体化治疗的目的。【方法】免疫组化检测212例NSCLC中PKR、IGF-1R表达情况,并用于Kaplan-Meier生存分析。Western Blotting检测13种肺癌细胞株PKR、p-PKR表达;磺基罗丹明B法(SRB)检测PPP、Rapamycin等药物作用后对高表达及低表达p-PKR细胞的抑制率。【结果】全组NSCLC患者中,PKRlow/IGF-1Rhigh患者的5年总生存率(21.6%)明显低于PKRhigh/IGF-1Rlow患者(74.6%)及其他患者(58.2%)(P<0.0001),单、多因素分析提示PKR/IGF-1R联合标记物为NSCLC患者总生存率的独立预后因素。SRB结果提示,第1～3天,IGF-1R抑制剂PPP 3μmol/L在6个肺癌细胞株中均能显著抑制细胞生长,在0.3μmol/L剂量低表达PKR和/或p-PKR的H1792和H292细胞株中,较其他细胞株更能抑制细胞生长。而mTOR抑制剂Rapamycin采用1、0.1及0.01μmol/L 3个剂量级在各细胞株均未见明显抑制细胞生长的区别。【结论】PKR联合IGF-1R可预测NSCLC的预后,PKR低表达的H1792、H292细胞株中,IGF-1R抑制剂PPP具有显著抑制作用,但对于mTOR抑制剂Rapamycin,未见明显作用,提示可通过检测PKR的表达来选择适合IGF-1R抑制剂PPP的病人。

肝炎病毒蛋白对双链RNA依赖性蛋白激酶的调节作用

乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)蛋白以及丁型肝炎病毒(HDV)基因组RNA与双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)之间可以进行特异性结合,使病毒感染的靶细胞对干扰素(IFN)的敏感性发生了改变。同时,肝炎病毒基因组及其编码产物与感染靶细胞中PKR分子之间的结合,将产生广泛的生物学效应。

宫颈病变中双链RNA依赖的蛋白激酶与HPV感染的相关性

目的:通过检测双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)、人乳头瘤病毒(HPV)在宫颈病变组织中的表达,探讨PKR在宫颈病变发生发展中的意义及可能机制。方法:选择临床病历资料和病理资料完整的宫颈癌患者共37例、同期宫颈上皮内瘤样病变(CIN)Ⅰ～Ⅲ患者56例为研究对象,因子宫肌瘤等良性病变切除子宫的正常宫颈组织30例为对照。采用免疫组织化学SABC法检测PKR及HPV16/18E6的表达,分析二者与宫颈病变发生发展的关系。结果:宫颈癌组织中PKR表达阳性率为54.1%,高于CINⅢ,CINⅠ～Ⅱ组和正常宫颈组,差异有统计学意义(P<0.05);在宫颈癌组中PKR表达与HPV16/18E6表达存在负相关(r=-0.554,P<0.05);在CINⅢ组中PKR表达与HPV16/18E6表达存在正相关(r=0.480,P=0.032)。结论:PKR的异常表达在CINⅢ向宫颈癌发展过程中可能发挥主要作用,此外SABC法测定PKR和E6的表达有可能成为筛选子宫颈癌的早期指标。

宫颈病变组织中双链RNA依赖的蛋白激酶表达

目的:检测宫颈癌及癌前病变组织中双链RNA-依赖的蛋白激酶(PKR)的表达,探讨PKR在宫颈病变发生发展中的意义及可能的机制。方法:选择临床病历资料和病理资料完整的宫颈癌患者共37例、同期宫颈上皮内瘤样病变(CINⅠ～CINⅢ)患者56例为研究对象,因子宫肌瘤等良性病变切除子宫的正常宫颈组织30例作为对照。采用免疫组织化学SABC法检测PKR的表达,分析PKR在宫颈病变发生、发展中的作用。结果:宫颈癌组织中PKR表达阳性率为54.1%(20/37),宫颈癌分期等临床病理资料均无明显相关(P>0.05);宫颈癌组PKR表达高于CINⅢ,CINⅠ～Ⅱ组和正常宫颈组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:PKR的异常表达在宫颈病变的发展过程中可能具有重要作用。

双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)的克隆表达及其对丙型肝炎病毒蛋白合成的抑制作用

α干扰素为治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的主要药物,但部分患者呈干扰素耐受而不能获得持久的病毒阴转,其可能的原因之一是病毒通过其编码的蛋白(NS5A及E2)抑制干扰素诱导的抗病毒效应分子———双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)的活性.而关于PKR是否在IFN-α抗HCV的机理中起抑制作用目前仍有争议.为研究PKR对HCV蛋白合成环节是否有抑制作用,通过构建野生型PKR真核表达载体(pPKRwt)及主要起负性调节作用的缺失突变PKR真核表达载体(pPKRΔ6),并将pPKRwt/pPKRΔ6与HCV复制子RNA同时转染Huh7细胞进行共表达,用Western印迹检测HCV IRES下游的NPTⅡ蛋白表达水平,与转染空载体的对照细胞及单用IFN-α处理的细胞相比较.结果显示:表达PKRwt的细胞中NPTⅡ蛋白水平低于转染空载体的对照细胞,但高于经IFN-α单独处理的细胞;表达PKRΔ6的细胞中NPTⅡ蛋白水平与对照细胞无明显差别,但PKRΔ能部分抵消IFN-α的抑制作用,说明在IFN-α抑制HCV IRES指导的蛋白合成中,PKR有一定的抑制作用,但可能还有其它的PKR非依赖机制参与.

钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ⅡδRNA干扰对下游基因表达及破骨细胞分化的影响

目的研究钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱδ(Ca2+/Calmodulin dependent kinaseⅡδ,Ca MKⅡδ)RNA干扰对下游基因表达及破骨细胞分化的影响,以证实其在破骨细胞分化中的作用。方法应用慢病毒构建Ca MKⅡδRNA干扰载体,并确定最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)值及转染效率。小鼠RAW264.7细胞分为对照组、空白载体组和干扰组。转染5 d后收获细胞,确定干扰效率;并检测RNA干扰对活化T细胞核因子蛋白c1(NFATc1)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、非受体酪氨酸激酶(c-Src)基因表达及破骨细胞分化的影响。结果成功构建了Ca MKⅡδRNA干扰载体,最佳转染MOI值为30,转染效率可达78%(P<0.05)。重组病毒对Ca MKⅡδ的干扰效率在mRNA水平超过78%,在蛋白水平超过70%(P<0.01)。Ca MKⅡδRNA干扰显著降低NFATc1、TRAP和c-Src基因,与对照组、空白载体组比较,其mRNA水平下降分别超过了47.8%、43.3%和48.5%(P<0.05,P<0.01),蛋白相对水平分别超过了61.1%、48.2%和39.6%%(P<0.01);免疫荧光细胞化学检测也得到相似结果。Ca MKⅡδRNA干扰也显著降低了破骨细胞生成及骨吸收功能;与其他两组比较,干扰组破骨细胞数、牙本质吸收陷窝数目和面积下降分别超过了49.8%、47.6%和61.3%(P<0.01)。结论 Ca MKⅡδRNA干扰可显著下调其下游NFATc1、TRAP、c-Src基因表达并抑制破骨细胞分化;Ca MKⅡδ在破骨细胞分化中可能发挥关键调控作用。

乳腺癌组织中DNA依赖蛋白激酶的表达变化

目的探讨乳腺癌组织中DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)的表达变化及其意义。方法采用免疫组化SP法检测56例乳腺癌组织及50例乳腺良性病变组织中DNA-PK的3个亚基DNA-PKcs、Ku70、Ku86的表达情况,同时检测这些组织中雌激素受体(ER)及癌基因c-erbB-2的表达。结果Ku70、Ku86在乳腺癌组织中的表达明显低于乳腺良性病变组织(P<0.01),而且Ku70和Ku86的表达随乳腺癌病理分级的升高而降低,但DNA-PKcs在两者中的表达则无明显变化。Ku70与Ku86的表达在ER阳性组高于ER阴性组,在c-erbB-2阳性组的表达则低于c-erbB-2阴性组,差异均有极显著性意义(均P<0.01)。结论Ku70和Ku86的低表达在乳腺癌的发生和发展中有重要意义,且其与ER、c-erbB-2关系密切,对乳腺癌的临床治疗及预后判断有一定的指导意义。

细胞周期依赖性蛋白激酶-5在C型尼曼-皮克病神经元变性中的作用

目的确定细胞周期依赖性蛋白激酶-5(cyclin dependent kinases-5,cdk5)在C型尼曼-皮克病(Niemann-Pickdisease type C,NPC)神经元变性过程中的作用,为NPC的临床治疗提供可能的药物作用靶点。方法将针对cdk5基因的si RNA序列克隆入rAAV-2载体,对4周龄npc-/-小鼠进行小脑rAAV-cdk5-si RNA-GFP注射(n=8),以空载体病毒(rAAV-GFP)注射组及非手术的同龄npc小鼠为对照(n=8)。在干预后4周连续观察小鼠脑内cdk5水平及小鼠神经生化和病理的改变。结果注射后1周可见针道附近、小脑深部核团及浦肯野细胞出现绿色荧光蛋白表达。与空载体病毒组相比,注射4周后小鼠脑内cdk5的表达水平降低34.17%(P<0.05,n=6);轴突球状体数量减少30.76%(P<0.05,n=6),存活浦肯野细胞数增加300%(P<0.05,n=8);细胞骨架蛋白磷酸化程度降低16.32%(P<0.05,n=6)。结论rAAV2-cdk5-si RNA小脑注射,能显著减轻npc小鼠神经生化和病理改变。cdk5的激活在NPC神经元变性过程中起到了关键性的作用,有可能成为NPC治疗的新靶标。

DNA依赖性蛋白激酶在妇科肿瘤中的研究进展

DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)是哺乳动物细胞DNA损伤修复的关键酶。研究表明,妇科肿瘤,如宫颈癌、卵巢癌中普遍存在DNA-PK表达的变化,提示该酶在妇科肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要的作用,并与肿瘤的临床分期、放射敏感性和预后有重要关系。近年来,关于DNA-PK的结构与功能、在肿瘤细胞株中的活性、在肿瘤组织中表达的研究日益深入,以DNA-PK为靶点的DNA修复抑制剂作为肿瘤放化疗增敏药已陆续研发并进入临床前试验,有望成为肿瘤诊断和治疗的新靶点。

老年性学习记忆减退与大鼠脑发育过程中周期素依赖性蛋白激酶5的表达(英文)

背景:周期素依赖性蛋白激酶5是周期素依赖性蛋白激酶家族的成员之一,脑发育过程中周期素依赖性蛋白激酶5m RNA 及其蛋白在脑内的表达及分布状况与神经退行性变思维认知学的关系一直被研究者关注。目的:探讨大脑发育过程中的周期素依赖性蛋白激酶5对神经系统的发生和退行性变的影响。设计:单因素方差分析实验。单位:解放军第一军医大学组织学与胚胎学教研室和神经生物学教研室。材料:实验在解放军第三军医大学组织学与胚胎学实验室完成。W istar大鼠胚胎期(E8～E21)、新生期(P0～P15)、幼年期(P16～2个月)、成年期(>2个月)及老年期(>8个月后)5个阶段25只大鼠,每组5只。方法:采用胚胎期至老年期大鼠脑片行原位杂交组织化学和免疫细胞化学染色。主要观察指标:不同脑区内周期素依赖性蛋白激酶5m RNA 及其蛋白的阳性细胞分布及表达状况。结果:25只大鼠全部进入结果分析。①周期素依赖性蛋白激酶5mRNA 在大鼠E14～P350整个发育过程中均有表达,成年后趋于稳定;周期素依赖性蛋白激酶5mRNA 主要定位于神经元,阳性区域主要分布于大脑皮质、海马、丘脑、下丘脑、小脑及部分神经核团。②出生后周期素依赖性蛋白激酶5表达较强,胚胎及老年鼠表达较弱;阳性区域集中在室周区、海马、小脑及部分神经核团内;老年鼠仅在海马、小脑蒲肯野细胞层内表达。结论:脑内周期素依赖性蛋白激酶5的作用贯穿了整个神经发育的各个时期,在新生期、幼年期有较为显著的表达,成年后表达下降,尤以老年期显著。老年大鼠海马内周期素依赖性蛋白激酶5的表达下调可能与老年性学习记忆减退的发生密切相关。

松材线虫磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1基因的克隆及表达

应用BLAST比对技术,在松材线虫基因组数据中鉴定得到模式线虫pdk–1的同源基因Bxpdk–1。结合RT–PCR技术进行Bxpdk–1基因完整蛋白编码区(CDS)扩增,得到CDS区全长2298bp。Bx PDK–1蛋白含有"STKc_PDK1""PH_PDK1"2个保守结构域,属于磷酸肌醇激酶超家族。序列比对及进化树分析显示,松材线虫Bx PDK–1蛋白与捻转血矛线虫PDK–1蛋白(CDJ88126.1)同源性为50%,进化树聚在同一小分支上,亲缘关系较近。原位杂交试验表明,Bxpdk–1基因主要在线虫的头部神经元及咽部神经处表达。q PCR结果分析显示,Bxpdk–1基因表达响应鱼藤酮药剂胁迫处理。RNAi试验显示,Bxpdk–1在dsRNA处理12 h时,基因表达量显著下降,基因被沉默。

抑制细胞周期依赖性蛋白激酶-5表达对C型尼曼-皮克病小鼠的神经保护作用

目的:观察抑制细胞周期依赖性蛋白激酶-5(cdk5)的表达对C型尼曼-皮克病(NPC)小鼠(npc-/-)的治疗作用。方法:采用携带cdk5特异性小干扰RNA(cdk5-siRNA)的重组腺相关病毒rAAV-cdk5-siRNA-GFP,对出生三天内的npc-/-小鼠进行双侧侧脑室注射,以rAAV-GFP注射组及非手术的同龄npc小鼠为对照(n=6～10/组);采用免疫组织化学染色、HE染色和小鼠衣架悬挂试验来评价小鼠脑内的神经病理改变和运动功能。结果:rAAV2-cdk5-siR-NA-GFP能显著减少轴突球状体的数量,延缓浦肯野细胞的死亡并改善npc-/-小鼠的运动功能。结论:降低cdk5的活性对npc-/-小鼠的神经元有一定的保护作用。

DNA依赖性蛋白激酶催化亚基在非同源末端连接修复中作用的研究进展

DNA的精确复制对维持基因组稳定性具有重要作用,而DNA双链断裂(DSB)损伤可能诱导细胞凋亡和染色质重排,在肿瘤的发生发展过程中发挥作用。DNA依赖性蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)是磷脂酰肌醇3-激酶样蛋白激酶(PIKK)家族中相对分子质量最大及表达量最高的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。与Ku70/80结合后,DNA-PKcs在离子辐射诱导DSB后的非同源末端连接(NHEJ)有效修复过程中,发挥非常重要的作用。DNA-PKcs或其他NHEJ修复因子的缺失会导致辐射敏感性和DSB的未修复,以及V(D)J重组缺陷和免疫缺陷。本文主要对DNA-PKcs的结构,在DSB位点的募集与激活,在NHEJ修复中的作用过程及其与疾病的关系进行总结与展望,希望能为DNA-PKcs的深入研究及临床应用提供理论基础。

新城疫病毒感染通过蛋白激酶激活NF-κB信号通路诱导干扰素和炎症因子的表达

[目的]本文旨在探究新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染过程中细胞因子显著上调的机制。[方法]NDV感染He La细胞,用RT-PCR法检测IFN-β、IL-6、IL-8 mRNA水平。Western blot分析和免疫荧光分析检测NDV对双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)与NF-κB信号通路的影响。[结果]与未感染组相比,IFN-β、IL-6、IL-8 mRNA水平显著上调。NF-κB信号通路在感染后12~24 h被激活,转录因子p65入核,而使用NF-κB信号通路抑制剂IKK16则显著降低了干扰素和炎症因子的表达,证明NF-κB信号通路介导NDV感染过程中的细胞因子表达和炎症反应。另外,在病毒感染过程中,病原模式识别受体PKR被诱导表达并且被磷酸化激活。使用抑制剂2-氨基嘌呤抑制PKR活性后,能够抑制p65的入核,并减少由NDV诱导的干扰素和炎症因子表达。[结论]NDV感染能够通过PKR调控NF-κB信号通路,引起细胞因子显著上调。

双链RNA依赖的蛋白激酶活性抑制剂对脓毒症小鼠器官损伤及炎症因子的影响

目的观察双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)抑制剂2-氨基嘌呤(2-AP)对盲肠结扎穿刺(CLP)的脓毒症模型小鼠器官损伤血浆炎症因子表达及死亡率的影响。方法无特异病原体(SPF)级C57BL/6小鼠40只,随机分为假手术(Sham)组、CLP组、2-AP组和CLP+2-AP组(n=10)。术后24 h收集外周血血清,进行丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、血肌酐(Cr)、血尿素氮(BUN)及炎症因子(IL-1β、IL-10和TNF-α)的检测;取肺组织进行病理检测;取外周血和腹腔灌洗液进行细菌清除率检测。另外取60只C57BL/6小鼠,按照上述分组(n=15)进行7 d生存率观察。组间计量资料比较采用独立样本t检验。结果CLP组和CLP+2-AP组小鼠肝损伤指标(ALT和AST水平)和肾损伤指标(Cr和BUN)均较Sham组显著升高(均P<0.001)。CLP+2-AP组ALT和AST水平均显著低于CLP组(t=27.88、11.33,均P<0.001);肾功能损伤指标方面,CLP+2-AP组Cr和BUN水平均较CLP组显著下降(t=11.02、7.15,均P<0.001)。与Sham组相比,CLP组血浆中促炎(IL-1β和TNF-α)及抑炎(IL-10)细胞因子水平均显著升高(均P<0.001);CLP+2-AP组小鼠血浆IL-1β和IL-10水平均显著降低(均P<0.001),而血浆TNF-α水平下降不明显(P=0.33)。Sham组小鼠7 d生存率为100%,CLP+2-AP组为13.3%,2-AP组为86.7%,CLP+2-AP组为20.0%。抑制PKR活化可轻微改善CLP模型小鼠7 d生存率趋势(Mantel-Cox检验分析,χ^2=0.0012,P=0.97)。结论在脓毒症小鼠模型中,抑制PKR活性可对降低血浆中炎症因子表达,减少血液和腹腔中细菌负荷,对器官损伤具有保护作用,提示抑制PKR活性在脓毒症治疗中具有应用潜力。

双链RNA依赖的蛋白激酶在放射性肺损伤中的作用及机制研究

目的:探讨双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)在放射性肺损伤中的作用和分子机制。方法:将20只雄性SD大鼠随机分成对照组和放射组,对照组不做任何处理,放射组大鼠左肺一次性给予20Gy照射,观察1个月。人肺泡上皮细胞(HPAEpiC)分别转染高、低表达的PKR后,给予15Gy照射。采用支气管肺泡灌洗液的分析、Masson染色、免疫组织化学、MTT法、Real-time PCR和Western blot等方法研究PKR在放射性肺损伤中的作用及机制。结果:与对照组比较,放射组大鼠体重明显较低,肺/体重比值明显较高(P<0.05);通过ELISA检测发现,放射组大鼠肺组织中促炎因子IL-1β和TNF-α相对表达水平显著高于对照组,而抑炎因子IL-10相对表达水平则明显低于对照组(P<0.05);Masson染色结果表明,放射组大鼠肺间隔纤维组织沉积显著高于对照组(P<0.05);放射组肺组织TUNEL阳性细胞及促凋亡因子Bax、Caspase-3的mRNA和蛋白水平明显高于对照组,且抗凋亡因子Bcl-2mRNA和蛋白水平显著低于对照组(P<0.05);放射组大鼠肺组织PKR蛋白表达水平明显低于对照组,而p-PKR蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05);实验结果表明,PKR敲低细胞照射组细胞生存率、PKR蛋白和抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达显著低于正常细胞照射组,而促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达显著高于正常细胞照射组(P<0.05);PKR过表达细胞照射组细胞生存率、PKR蛋白和抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达显著高于正常细胞照射组,而促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达显著低于正常细胞照射组(P<0.05)。结论:放射可以导致严重的肺损伤,肺损伤发生机制可能与PKR通路有关。

一种大规模制备双链RNA的简单方法及其在斑节对虾中的应用

RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)诱发的特异性沉默目的基因表达的过程,一种大规模制备双链RNA的方法可以便利RNAi技术的应用。以斑节对虾kazal型蛋白激酶抑制剂(KPI)基因为例,详细介绍了一种以体内载体表达大量制备dsRNA(>300nt)的方法。使用商业载体pGEMT和pDRIVE,以2步克隆法构建含有发夹环(hairpin loop)dsRNA表达载体,转化RNA酶Ⅲ缺陷的大肠杆菌HT115(DE3)进行体内转录制备dsRNA。构建的发夹RNA表达载体含有494bp的正向靶序列和403bp的反向互补靶序列,其中正向靶序列多出的91bp即可成为loop环,而无需再次克隆加入。培养30mL的细菌,即可得到1mg纯化的dsRNA,而其成本仅为使用商业化体外转录试剂盒的四分之一。为评估RNAi效果,按照每1克虾体肌肉注射2μg dsRNA的剂量,在dsRNA注射后0,6,12和24h采集血淋巴,RT-PCR检测KPI mRNA的基因转录水平。与对照组GFP-dsRNA和NaCl注射组相比,KPI-dsRNA注射组可以在24h内沉默血淋巴中的KPI基因。结果表明该方法是可大规模制备长的dsRNA的方法。