非酒精性脂肪性肝病中蛋白激酶R样内质网激酶/真核翻译起始因子-2α通路的变化及意义

目的:又见察蛋白激酶R样内质网激酶/真核翻译起始因子-2α(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase/eukaryotic translation initator factor-2α,PERK/eIF-2α)信号通路在大鼠实验性非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)中的变化并探讨该信号通路在NAFLD中可能的作用.方法:健康Wistar大鼠30只,雌雄不限,按照随机数字表法分为正常对照组和NAFLD组,每组各15只.NAFLD组大鼠采用高脂高糖饮食诱导NAFLD的发生,而正常对照组大鼠则给予普通饲料喂养,时间总计为16 wk.检测血清中总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三醋(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(highdensity lipoprotein,HDL)和低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein,LDL)的含量;实时荧光定量PCR技术检测肝脏中PERK,eIF-2α、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)及葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)等指标在mRNA水平的表达改变;蛋白质免疫印迹(Western blot)技术检测肝脏中磷酸化PERK(pPERK),磷酸化eIF-2α(p-eIF-2α),CHOP及GRP78等指标在蛋白水平的改变;同时采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果:NAFLD组大鼠血清中TC、TG、LDL含量较正常对照组明显增高(P<0.05),而HDL则明显低于正常对照组大鼠(P<0.05);PCR结果发现,NAFLD组大鼠肝组织中PERK,eIF-2α、CHOP及GRP78的mRNA表达水平均较正常对照组大鼠显著升高(P<0.05或P<0.01):同时Western blot结果显示NAFLD大鼠肝脏中p-PERK,p-eIF-2α,CHOP及GRP78等指标的蛋白水平表达较正常对照组大鼠明显增多(P<0.05);此外,流式细胞仪检测发现NAFLD大鼠肝细胞凋亡较正常对照组大鼠显著升高.结论:NAFLD的发生发展过程中可能有内质网应激诱导细胞凋亡通路PERK/eIF-2α的参与.

丹参多酚酸对PAP小鼠大脑海马组织内质网应激通路的影响

目的探讨丹参多酚酸对PAP小鼠脑海马组织内质网应激(ERS)通路的影响.方法选择PAP双转基因雄性小鼠20只,按随机数字表法分为PAP小鼠模型组和丹参多酚酸给药组,每组10只;另选择SPF级C57BL/6J雄性小鼠10只作为正常对照组.丹参多酚酸给药组经尾静脉注射丹参多酚酸0.9%生理盐水溶液(400 g/L),剂量21 mg·kg^-1·d^-1;PAP小鼠模型组和正常对照组给予等量生理盐水,3组均持续给药4周.在第4周末进行Morris水迷宫实验,观察各组小鼠逃避潜伏期、第三象限停留时间(RTQ)、入水朝向角度和跨越平台次数的变化;并检测各组小鼠大脑海马组织淀粉样前体蛋白(APP)阳性细胞、双链RNA样内质网激酶(PERK)-真核起始因子2α-增强子结合同源蛋白(PERK-eIF2α-CHOP)通路相关蛋白的表达水平.结果PAP小鼠模型组第1~5天逃避潜伏期均较正常对照组明显延长,第5天时有下降趋势,但仍明显高于正常对照组(s:58.41±2.36比28.6±10.15);丹参多酚酸给药组各时间点逃避潜伏期均较PAP小鼠模型组明显缩短,第5天时达到最低水平(s:31.97±8.36比58.41±2.36).PAP小鼠模型组RTQ、跨越平台次数均较正常对照组明显降低〔RTQ(s):8.27±2.95比15.97±7.33,跨越平台次数(次/90 s):0.70±0.47比2.70±0.48〕,而入水朝向角度较正常对照组明显增大〔(47.94±4.68)°比(32.66±2.55)°,P<0.05〕.丹参多酚酸给药组RTQ、跨越平台次数均较PAP小鼠模型组明显增加〔RTQ(s):13.57±1.86比8.27±2.95,跨越平台次数(次/90 s):1.60±0.97比0.70±0.47〕,而入水朝向角度较PAP小鼠模型组明显减小〔(35.46±6.79)°比(47.94±4.68)°,P<0.05).PAP小鼠模型组APP阳性表达率和CHOP、p-eIF2α蛋白表达均较正常对照组明显增多〔APP阳性表达率:(60.44±6.19)%比(21.05±5.87)%,CHOP蛋白表达(灰度值):3.09±0.07比1.46±0.09,p-eIF2α蛋白表达(灰度值):0.98±0.09比0.47±0.06,均P<0.01〕,PERK、p-PERK蛋白表达均较正常对照组减少〔PERK蛋白表达(灰度值):0.42±0.06比0.82±0.11,p-PERK蛋白表达(灰度值):0.98±0.09比0.64±0.10,均P<0.01〕;丹参多酚酸给药组APP阳性表达率和CHOP、p-eIF2α蛋白表达水平均较PAP小鼠模型组明显著减少〔APP阳性表达率:(33.09±10.33)%比(60.44±6.19)%,CHOP蛋白表达(灰度值):1.57±0.12比3.09±0.07,p-eIF2α蛋白表达(灰度值):0.80±0.07比0.98±0.09,均P<0.01〕,PERK、p-PERK蛋白表达较PAP小鼠模型组明显增加〔PERK蛋白表达(灰度值):0.89±0.12比0.42±0.06,p-PERK蛋白表达(灰度值):0.78±0.08比0.98±0.09,均P<0.01〕.结论丹参多酚酸可能通过PERK-eIF2α-CHOP通路减少PAP双转基因小鼠海马组织APP的蓄积,从而改善PAP双转基因小鼠的学习能力,延缓脑损伤的进程.

木犀草素介导PERK/eIF2α/CHOP信号通路改善新生大鼠坏死性小肠结肠炎的作用研究

目的探讨木犀草素介导蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)/真核翻译启动因子2α(eIF2α)/CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)信号通路改善新生大鼠坏死性小肠结肠炎(NEC)的作用及相关机制。方法取新生SD大鼠30只,其中24只采用缺氧冷刺激法建立NEC大鼠模型,按随机数字表法分为木犀草素17.5 mg/kg组、木犀草素35 mg/kg组、木犀草素70 mg/kg组、模型组,另6只大鼠设为正常组(仅予0.1 mL 0.9%氯化钠溶液干预处理),1次/d,连续灌胃给药4 d。取大鼠小肠上皮细胞系IEC-6细胞采用脂多糖刺激法建立NEC细胞模型并分为木犀草素5μmol/L组、10μmol/L组、20μmol/L组、模型组,取未经脂多糖处理的IEC-6细胞设为正常组(仅予0.9%氯化钠溶液干预处理);另取建模后的IEC-6细胞分为GSK26064140.5μmol/L组、GSK26064141.0μmol/L组、GSK26064142.0μmol/L组、GSK26064144.0μmol/L组、模型组(仅予等体积0.9%氯化钠溶液干预处理),采用噻唑蓝法筛选细胞存活率最高的药物浓度(木犀草素20μmol/L,GSK26064144.0μmol/L)作为后续实验浓度,增设木犀草素20μmol/L+GSK26064144.0μmol/L组。采用HE染色观察大鼠肠道组织病理学变化,采用原位末端转移酶标记法、ELISA法、Western blot法分别检测木犀草素对大鼠肠道组织凋亡率,大鼠肠道组织、血清及IEC-6细胞中TNF-α、IL-6水平,以及大鼠肠道组织及IEC-6细胞中PERK/eIF2α/CHOP信号通路相关因子表达水平的影响。结果与模型组比较,木犀草素35 mg/kg组、木犀草素70 mg/kg组大鼠肠道组织损伤均有不同程度的改善,且细胞凋亡率均明显较低(均P<0.05)。与模型组比较,木犀草素35 mg/kg组、木犀草素70 mg/kg组大鼠肠道组织中TNF-α、IL-6水平明显较低(均P<0.05),木犀草素17.5 mg/kg组、木犀草素35 mg/kg组、木犀草素70 mg/kg组大鼠肠道组织中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表达水平以及血清中TNF-α、IL-6水平均明显较低(均P<0.05),木犀草素20μmol/L组IEC细胞中TNF-α、IL-6以及p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表达水平均明显较低(均P<0.05);与木犀草素20μmol/L组比较,木犀草素20μmol/L+GSK26064144.0μmol/L组IEC-6细胞中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表达水平均明显较低(均P<0.05)。结论木犀草素可有效改善新生大鼠NEC,其作用机制可能与下调TNF-α、IL-6以及p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表达水平进而抑制炎症反应有关。