双链RNA依赖的蛋白激酶与阿尔茨海默病相关性研究进展

阿尔茨海默病(AD)是一种严重威胁人类健康的疾病,也是引起人类死亡的三大因素之一。双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)又称为前炎症细胞因子,是人类先天免疫干扰素刺激因子之一。在AD发生和发展中,PKR表达上调并持续激活,一方面引发脑组织细胞发生整合应激反应,另一方面间接上调β位淀粉样前体蛋白裂解酶1的表达,促进β淀粉样蛋白(Aβ)的积累,而Aβ的积累又可以激活PKR,进一步促进Aβ的积累,形成一个Aβ持续积累的循环。PKR还可以促进Tau蛋白磷酸化,降低神经细胞微管稳定性。脑组织炎症反应、Aβ的积累所引起神经毒性和微管稳定性的破坏会导致AD发生发展,引起患者记忆和认知的下降,因此PKR是AD发生发展中的关键分子。有效进行PKR检测可以预测AD进展,为临床治疗AD提供先机。目前PKR已成为研发治疗AD药物的靶点,因此靶向PKR的抑制剂有望控制PKR的活性,从而有效控制AD发生发展。

双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)的克隆表达及其对丙型肝炎病毒蛋白合成的抑制作用

α干扰素为治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的主要药物,但部分患者呈干扰素耐受而不能获得持久的病毒阴转,其可能的原因之一是病毒通过其编码的蛋白(NS5A及E2)抑制干扰素诱导的抗病毒效应分子———双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)的活性.而关于PKR是否在IFN-α抗HCV的机理中起抑制作用目前仍有争议.为研究PKR对HCV蛋白合成环节是否有抑制作用,通过构建野生型PKR真核表达载体(pPKRwt)及主要起负性调节作用的缺失突变PKR真核表达载体(pPKRΔ6),并将pPKRwt/pPKRΔ6与HCV复制子RNA同时转染Huh7细胞进行共表达,用Western印迹检测HCV IRES下游的NPTⅡ蛋白表达水平,与转染空载体的对照细胞及单用IFN-α处理的细胞相比较.结果显示:表达PKRwt的细胞中NPTⅡ蛋白水平低于转染空载体的对照细胞,但高于经IFN-α单独处理的细胞;表达PKRΔ6的细胞中NPTⅡ蛋白水平与对照细胞无明显差别,但PKRΔ能部分抵消IFN-α的抑制作用,说明在IFN-α抑制HCV IRES指导的蛋白合成中,PKR有一定的抑制作用,但可能还有其它的PKR非依赖机制参与.

双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)的真核表达、纯化及鉴定

[目的]获得真核表达的Flag-PKR融合蛋白,以用于流感病毒相关的PKR信号通路调控机制研究。[方法]以RT-PCR方法扩增PKR目的基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.0-Flag中。将所构建的重组质粒pcDNA3.0-Flag-PKR转染293T细胞,利用Flag抗体偶联的琼脂糖凝胶(anti-Flag M2-Agarose)纯化Flag-PKR融合蛋白,所得产物进行SDS-PAGE、Western blot及体外活性鉴定。[结果]重组质粒转染293T细胞,Western blot显示表达出的融合蛋白能够被抗Flag的抗体特异性识别,其相对分子量约为69 kDa,与Flag-PKR融合蛋白大小相符;体外磷酸化试验表明,Flag-PKR融合蛋白能够发生自动磷酸化。[结论]在293T细胞中表达、纯化了有活性的Flag-PKR融合蛋白,为PKR信号通路的研究奠定了基础。

肝炎病毒蛋白对双链RNA依赖性蛋白激酶的调节作用

乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)蛋白以及丁型肝炎病毒(HDV)基因组RNA与双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)之间可以进行特异性结合,使病毒感染的靶细胞对干扰素(IFN)的敏感性发生了改变。同时,肝炎病毒基因组及其编码产物与感染靶细胞中PKR分子之间的结合,将产生广泛的生物学效应。

双链RNA依赖的蛋白激酶在非小细胞肺癌预后预测及靶向治疗中的作用

【目的】探索双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)联合其他肿瘤代谢相关蛋白能否作为非小细胞肺癌(NSCLC)的更有效的预测因子;同时拟研究部分肿瘤代谢相关化合物,如胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)抑制剂、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂等与PKR表达的关系,拟求达到更好的靶向治疗及个体化治疗的目的。【方法】免疫组化检测212例NSCLC中PKR、IGF-1R表达情况,并用于Kaplan-Meier生存分析。Western Blotting检测13种肺癌细胞株PKR、p-PKR表达;磺基罗丹明B法(SRB)检测PPP、Rapamycin等药物作用后对高表达及低表达p-PKR细胞的抑制率。【结果】全组NSCLC患者中,PKRlow/IGF-1Rhigh患者的5年总生存率(21.6%)明显低于PKRhigh/IGF-1Rlow患者(74.6%)及其他患者(58.2%)(P<0.0001),单、多因素分析提示PKR/IGF-1R联合标记物为NSCLC患者总生存率的独立预后因素。SRB结果提示,第1～3天,IGF-1R抑制剂PPP 3μmol/L在6个肺癌细胞株中均能显著抑制细胞生长,在0.3μmol/L剂量低表达PKR和/或p-PKR的H1792和H292细胞株中,较其他细胞株更能抑制细胞生长。而mTOR抑制剂Rapamycin采用1、0.1及0.01μmol/L 3个剂量级在各细胞株均未见明显抑制细胞生长的区别。【结论】PKR联合IGF-1R可预测NSCLC的预后,PKR低表达的H1792、H292细胞株中,IGF-1R抑制剂PPP具有显著抑制作用,但对于mTOR抑制剂Rapamycin,未见明显作用,提示可通过检测PKR的表达来选择适合IGF-1R抑制剂PPP的病人。

宫颈病变中双链RNA依赖的蛋白激酶与HPV感染的相关性

目的:通过检测双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)、人乳头瘤病毒(HPV)在宫颈病变组织中的表达,探讨PKR在宫颈病变发生发展中的意义及可能机制。方法:选择临床病历资料和病理资料完整的宫颈癌患者共37例、同期宫颈上皮内瘤样病变(CIN)Ⅰ～Ⅲ患者56例为研究对象,因子宫肌瘤等良性病变切除子宫的正常宫颈组织30例为对照。采用免疫组织化学SABC法检测PKR及HPV16/18E6的表达,分析二者与宫颈病变发生发展的关系。结果:宫颈癌组织中PKR表达阳性率为54.1%,高于CINⅢ,CINⅠ～Ⅱ组和正常宫颈组,差异有统计学意义(P<0.05);在宫颈癌组中PKR表达与HPV16/18E6表达存在负相关(r=-0.554,P<0.05);在CINⅢ组中PKR表达与HPV16/18E6表达存在正相关(r=0.480,P=0.032)。结论:PKR的异常表达在CINⅢ向宫颈癌发展过程中可能发挥主要作用,此外SABC法测定PKR和E6的表达有可能成为筛选子宫颈癌的早期指标。

程序性细胞死亡配体1、P21激活蛋白激酶6、长链非编码RNA SNHG20表达与乳腺癌患者放疗敏感性相关性

目的探讨程序性细胞死亡配体1(PD-L1)、P21激活蛋白激酶6(PAK6)、长链非编码RNA SNHG20(lnc RNA SNHG20)表达与乳腺癌患者放疗敏感性的相关性。方法选取康复大学青岛中心医院自2021年1月至2024年1月收治的98例乳腺癌患者为研究对象。所有患者均进行乳腺癌改良根治术治疗,并于术后辅以放疗。根据疗效评定结果,将患者分为放疗敏感组(完全缓解+部分缓解,n=59)与放疗不敏感组(疾病稳定+疾病进展,n=39)。比较两组患者的基线资料及PD-L1、PAK6、lnc RNA SNHG20 mRNA表达情况。采用多因素Logistic回归分析法检验乳腺癌患者放疗敏感性的影响因素。应用受试者工作特征(ROC)曲线评估PD-L1、lnc RNA SNHG20、PAK6对乳腺癌患者放疗敏感性的预测价值。结果两组患者分化程度、肿瘤直径、国际抗癌联盟(TNM)分期比较,差异均有统计学意义(P<0.05);放疗不敏感组患者淋巴结转移比例高于放疗敏感组,差异有统计学意义(P<0.05)。放疗敏感组患者乳腺病理组织中PD-L1、PAK6、lnc RNA SNHG20 mRNA相对表达量均低于放疗不敏感组,差异均有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示,TNM分期、分化程度、PD-L1、PAK6和lnc RNA SNHG20均为乳腺癌患者放疗不敏感的影响因素(P<0.05)。ROC曲线显示,PD-L1、PAK6、lnc RNA SNHG20三者联合检测对乳腺癌放疗敏感性的预测效能最高,ROC曲线下面积为0.975。结论PD-L1、PAK6、lnc RNA SNHG20表达均与乳腺癌患者放疗敏感性有关,三者联合检测对放疗敏感性的预测效能更高。

新城疫病毒感染通过蛋白激酶激活NF-κB信号通路诱导干扰素和炎症因子的表达

[目的]本文旨在探究新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染过程中细胞因子显著上调的机制。[方法]NDV感染He La细胞,用RT-PCR法检测IFN-β、IL-6、IL-8 mRNA水平。Western blot分析和免疫荧光分析检测NDV对双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)与NF-κB信号通路的影响。[结果]与未感染组相比,IFN-β、IL-6、IL-8 mRNA水平显著上调。NF-κB信号通路在感染后12~24 h被激活,转录因子p65入核,而使用NF-κB信号通路抑制剂IKK16则显著降低了干扰素和炎症因子的表达,证明NF-κB信号通路介导NDV感染过程中的细胞因子表达和炎症反应。另外,在病毒感染过程中,病原模式识别受体PKR被诱导表达并且被磷酸化激活。使用抑制剂2-氨基嘌呤抑制PKR活性后,能够抑制p65的入核,并减少由NDV诱导的干扰素和炎症因子表达。[结论]NDV感染能够通过PKR调控NF-κB信号通路,引起细胞因子显著上调。

微小RNA-133a-5p在丙泊酚防治大鼠肝脏缺血再灌注损伤中的作用及作用机制

目的观察微小RNA-133a-5p(miR-133a-5p)在丙泊酚防治大鼠肝脏缺血再灌注(I/R)损伤中的作用,并探讨其可能作用机制。方法①丙泊酚对I/R大鼠肝功能及肝组织miR-133a-5p、有丝分裂原激活蛋白激酶6(mitogen-activated protein kinase 6,MAPK6)mRNA表达的影响观察:取18只大鼠分为丙泊酚组、模型组及对照组,每组6只。丙泊酚组及模型组对肝脏组织进行缺血再灌注操作,丙泊酚组在缺血再灌注操作的同时注射丙泊酚0.6 mg/(kg·min)。再灌注结束时采集各组大鼠下腔静脉血4 mL,采用全自动生化分析仪检测大鼠血清肝功能指标天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT),采血后处死各组大鼠分离肝脏组织,采用qRT-PCR法检测大鼠肝组织miR-133a-5p、MAPK6 mRNA。②miR-133a-5p抑制剂联合丙泊酚对I/R大鼠肝功能及肝组织miR-133a-5p、MAPK6mRNA表达的影响观察:另取24只大鼠分为甲、乙、丙、丁组,每组6只。四组均对肝脏组织进行缺血再灌注操作,甲组在缺血再灌注操作的同时注射丙泊酚0.6 mg/(kg·min)及miR-133a-5p抑制剂,乙组、丙组在缺血再灌注操作的同时分别注射丙泊酚0.6 mg/(kg·min)、丙泊酚+等量生理盐水,丁组不做任何处理。再灌注结束时采集各组大鼠下腔静脉血4 mL,采用全自动生化分析仪检测血清ALT、AST,采血后处死各组大鼠分离肝脏组织,采用qRT-PCR法检测四组大鼠肝组织miR-133a-5p、MAPK6mRNA。结果与对照组相比,模型组大鼠血清AST、ALT活性升高,肝脏组织miR-133a-5p相对表达量降低、MAPK6mRNA相对表达量升高(P均<0.01);与模型组相比,丙泊酚组大鼠血清AST、ALT水平降低,肝组织miR-133a-5p相对表达量升高、MAPK6mRNA相对表达量降低(P均<0.05)。与乙组相比,甲组大鼠血清ALT和AST水平高,肝组织MAPK6mRNA相对表达量高(P均<0.01);与乙和丙组相比,丁组大鼠血清ALT和AST水平升高,肝组织MAPK6mRNA相对表达量高(P均<0.01)。结论注射丙泊酚后肝脏I/R大鼠的肝损伤程度减轻,肝脏组织miR-133a-5p表达升高、MAPK6 mRNA表达降低。抑制miR-133a-5p表达可逆转丙泊酚对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的防治作用。丙泊酚可能通过促进肝脏组织miR-133a-5p表达,抑制肝组织MAPK6 mRNA表达,减轻大鼠的肝脏I/R损伤。

一种大规模制备双链RNA的简单方法及其在斑节对虾中的应用

RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)诱发的特异性沉默目的基因表达的过程,一种大规模制备双链RNA的方法可以便利RNAi技术的应用。以斑节对虾kazal型蛋白激酶抑制剂(KPI)基因为例,详细介绍了一种以体内载体表达大量制备dsRNA(>300nt)的方法。使用商业载体pGEMT和pDRIVE,以2步克隆法构建含有发夹环(hairpin loop)dsRNA表达载体,转化RNA酶Ⅲ缺陷的大肠杆菌HT115(DE3)进行体内转录制备dsRNA。构建的发夹RNA表达载体含有494bp的正向靶序列和403bp的反向互补靶序列,其中正向靶序列多出的91bp即可成为loop环,而无需再次克隆加入。培养30mL的细菌,即可得到1mg纯化的dsRNA,而其成本仅为使用商业化体外转录试剂盒的四分之一。为评估RNAi效果,按照每1克虾体肌肉注射2μg dsRNA的剂量,在dsRNA注射后0,6,12和24h采集血淋巴,RT-PCR检测KPI mRNA的基因转录水平。与对照组GFP-dsRNA和NaCl注射组相比,KPI-dsRNA注射组可以在24h内沉默血淋巴中的KPI基因。结果表明该方法是可大规模制备长的dsRNA的方法。

下调let－7微小RNA对卡波西肉瘤相关疱疹病毒裂解复制和丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶激酶4及其下游因子的影响

目的 探讨下调let－7微小RNA（miRNA）的表达对卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）裂解复制的影响。方法 采用miRNA海绵技术抑制let－7 miRNAs的表达，脂质体法将pEGFP－C2－let－7 sponge质粒转染到BCBL－1和293T细胞中。实时荧光定量PCR法检测let－7 miRNAs的表达，丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶激酶4（MAP4K4）、环氧合酶2（COX－2）和基质金属蛋白酶13（MMP－13）mRNA的表达以及KSHV开放读码框（ORF）50和ORF72基因DNA复制水平。Western blot法检测MAP4K4和COX－2蛋白的表达以及p38丝裂原活化蛋白激酶、细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）和c－Jun氨基末端激酶（JNK）蛋白的表达及磷酸化水平。结果 在BCBL－1细胞中，let－7 sponge组中let－7 miRNAs的相对表达水平与空载体组比较，差异均有统计学意义（均P〈0.05）；在293T细胞中，let－7 sponge组中let－7a、let－7b、let－7c、let－7d、let－7e、let－7f、let－7g和let－7i的相对表达水平与空载体组比较，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。质粒转染BCBL－1细胞48 h后，空载体组和let－7 sponge组中KSHV ORF50 DNA的相对复制水平分别为1.00±0.10和2.33±0.18，差异有统计学意义（P〈0.001）; KSHV ORF50 mRNA的相对表达水平分别为1.08±0.48和3.22±0.27，差异有统计学意义（P〈0.001）。空载体组和let－7 sponge组中KSHV ORF72 DNA的相对复制水平分别为1.07±0.49和1.67±0.45，mRNA相对表达水平分别为1.01±0.19和1.54±0.11，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。转染质粒48 h后，空载体组和let－7 sponge组中MAP4K4 mRNA的相对表达水平分别为1.00±0.05和5.73±0.96，COX－2 mRNA的相对表达水平分别为1.00±0.05和2.68±0.19，MMP－13 mRNA的相对表达水平分别为1.00±0.02和2.69±0.25，差异均有统计学意义（均P〈0.001）。let－7 sponge组与空载体组比较，MAP4K4和COX－2的蛋白表达水平也明显提高。在BCBL－1细胞中let－7 miRNAs的表达下调时，KSHV ORF50和ORF72 mRNA的表达水平增加，KSHV ORF50和ORF72 DNA的复制水平增加，MAP4K4、COX－2和MMP－13 mRNA的表达上调。在293T和BCBL－1细胞中，let－7 sponge组的ERK1/2磷酸化水平高于空载体组，但p38和JNK磷酸化水平无变化。结论 抑制细胞let－7 miRNAs的表达可激活KSHV复制，其可能是通过上调其靶基因MAP4K4的表达，上调MAP4K4下游因子COX－2和MMP－13的表达水平及ERK1/2磷酸化水平来诱发KSHV的激活，最终导致卡波西肉瘤的发生和发展。

利用蛋白导入法沉默线粒体分裂调节蛋白Drp1的表达

目的:表达和纯化3转录反式激活因子-RNA结合结构域(3 Trans-Activator of Transcription-RNA binding domain,3TATRBD)重组蛋白,并利用蛋白导入法将siRNA运输到细胞中进行基因沉默实验。方法:将双链RNA激活蛋白激酶PKR的RNA结合域(Motif1)与细胞穿膜多肽TAT融合构建3TAT-RBD,并通过原核表达体系进行目的蛋白的表达和纯化。获取重组3TATRBD蛋白后,利用非变性胶电泳检测3TAT-RBD与荧光标示Cy3-dsRNA的结合能力。利用蛋白导入法和荧光显微镜观察3TAT-RBD将Cy3-dsRNA导入胶质瘤细胞的效率。在细胞水平检测和比较3TAT-RBD和Lipofectimine 2000将Cy3-dsRNA导入细胞的效率以及对沉默线粒体分裂蛋白动力蛋白相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)的效果。结果:通过原核表达体系获得3TAT-RBD重组蛋白,体外结合实验证实3TAT-RBD与双链dsRNA具有良好的结合能力。荧光显微镜观察也发现3TAT-RBD与Lipofectimine 2000均能将Cy3-dsRNA导入gli36胶质细胞。在RNA干扰实验中发现,3TAT-RBD和Lipofectimine2000均能有效地抑制Drp1的表达,Lipo+siRNA和3TAT-RBD+siRNA组Drp1的表达水平分别为对照组的36%和42%。结论:本研究中构建的3TAT-RBD利用了细胞穿膜多肽和RBD与dsRNA结合特性,有效地将siRNA导入细胞进行基因沉默实验,这将为今后RNA干扰实验提供新的工具。

抑制长链非编码RNA FAL1表达对上皮性卵巢癌细胞生物学行为的影响及其分子机制

目的:探索上皮性卵巢癌细胞与正常人卵巢细胞中长链非编码RNA(lncRNA)FAL1的表达差异及沉默卵巢癌细胞株SKVO3中lncRNA FAL1的表达对卵巢癌细胞侵袭、迁移及凋亡的影响。方法:利用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)技术检测组织中lncRNA FAL1表达水平;设计并合成FAL1-siRNA引物序列转染SKVO3,通过细胞划痕试验检测卵巢癌细胞的迁移能力,Transwell侵袭实验检测卵巢癌细胞的侵袭能力,流式细胞术检测卵巢癌细胞的凋亡,蛋白质印迹(Western blotting)检测磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)和磷酸化丝裂原细胞外激酶1/2(p-MEK1/2)蛋白的表达水平。结果:lncRNA FAL1在卵巢癌组织中的表达高于正常卵巢组织([15.04±2.24)vs.(2.93±0.39),P<0.05]。沉默lnc RNA FAL1的表达后,卵巢癌细胞的凋亡能力显著增强([18.38±0.73)%vs.(2.86±0.09)%,P<0.05],而卵巢癌细胞迁移、侵袭能力均降低([6.68±1.49)μm vs.(12.85±2.56)μm,(25.80±2.59)个vs.(145.6±5.23)个,均P<0.05],MEK/ERK通路MEK1/2和ERK1/2蛋白磷酸化水平明显降低(P<0.05)。结论:lncRNA FAL1通过激活MEK/ERK通路影响上皮性卵巢癌细胞的侵袭、迁移及凋亡,其表达异常增高可能是卵巢癌发生发展的重要分子机制。

双链RNA依赖的蛋白激酶活性抑制剂对脓毒症小鼠器官损伤及炎症因子的影响

目的观察双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)抑制剂2-氨基嘌呤(2-AP)对盲肠结扎穿刺(CLP)的脓毒症模型小鼠器官损伤血浆炎症因子表达及死亡率的影响。方法无特异病原体(SPF)级C57BL/6小鼠40只,随机分为假手术(Sham)组、CLP组、2-AP组和CLP+2-AP组(n=10)。术后24 h收集外周血血清,进行丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、血肌酐(Cr)、血尿素氮(BUN)及炎症因子(IL-1β、IL-10和TNF-α)的检测;取肺组织进行病理检测;取外周血和腹腔灌洗液进行细菌清除率检测。另外取60只C57BL/6小鼠,按照上述分组(n=15)进行7 d生存率观察。组间计量资料比较采用独立样本t检验。结果CLP组和CLP+2-AP组小鼠肝损伤指标(ALT和AST水平)和肾损伤指标(Cr和BUN)均较Sham组显著升高(均P<0.001)。CLP+2-AP组ALT和AST水平均显著低于CLP组(t=27.88、11.33,均P<0.001);肾功能损伤指标方面,CLP+2-AP组Cr和BUN水平均较CLP组显著下降(t=11.02、7.15,均P<0.001)。与Sham组相比,CLP组血浆中促炎(IL-1β和TNF-α)及抑炎(IL-10)细胞因子水平均显著升高(均P<0.001);CLP+2-AP组小鼠血浆IL-1β和IL-10水平均显著降低(均P<0.001),而血浆TNF-α水平下降不明显(P=0.33)。Sham组小鼠7 d生存率为100%,CLP+2-AP组为13.3%,2-AP组为86.7%,CLP+2-AP组为20.0%。抑制PKR活化可轻微改善CLP模型小鼠7 d生存率趋势(Mantel-Cox检验分析,χ^2=0.0012,P=0.97)。结论在脓毒症小鼠模型中,抑制PKR活性可对降低血浆中炎症因子表达,减少血液和腹腔中细菌负荷,对器官损伤具有保护作用,提示抑制PKR活性在脓毒症治疗中具有应用潜力。

抗病毒蛋白PKR的结构和功能

病毒感染后，细胞合成分泌大量的干扰素（In—terferon，IFN），这些IFN通过自分泌或旁分泌的方式与细胞膜上的受体结合。激活STAT／JAK信号级联反应，调控300多个干扰素调控基因（Interferonstimulatedgenes，ISGs）的转录翻译水平，其中包括经典的抗病毒蛋白PKR。PKR即双链RNA依赖性蛋白激酶，是一种丝／苏氨酸蛋白激酶。

冬凌草甲素对HepG2细胞内质网应激蛋白IRE-1、PERK和CHOP的作用研究

目的研究内质网应激对冬凌草甲素处理的肝癌细胞HepG2的作用。方法采用特异性小干扰RNA(siRNA)转染HepG2细胞72 h抑制内质网应激蛋白RNA激活蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、抑制物阻抗性酯酶1(IRE-1)和CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)表达后,MTT法观察40μmol·L-1冬凌草甲素处理12h的转染细胞的细胞存活率。结果 PERK和IRE-1 siRNA转染抑制相应蛋白表达后增加冬凌草甲素诱导的HepG2细胞死亡(P<0.05);而抑制CHOP表达对冬凌草甲素处理的HepG2细胞存活率没有影响(P>0.05)。结论冬凌草甲素诱导的内质网应激对HepG2细胞具有保护作用。

双链RNA依赖的蛋白激酶在放射性肺损伤中的作用及机制研究

目的:探讨双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)在放射性肺损伤中的作用和分子机制。方法:将20只雄性SD大鼠随机分成对照组和放射组,对照组不做任何处理,放射组大鼠左肺一次性给予20Gy照射,观察1个月。人肺泡上皮细胞(HPAEpiC)分别转染高、低表达的PKR后,给予15Gy照射。采用支气管肺泡灌洗液的分析、Masson染色、免疫组织化学、MTT法、Real-time PCR和Western blot等方法研究PKR在放射性肺损伤中的作用及机制。结果:与对照组比较,放射组大鼠体重明显较低,肺/体重比值明显较高(P<0.05);通过ELISA检测发现,放射组大鼠肺组织中促炎因子IL-1β和TNF-α相对表达水平显著高于对照组,而抑炎因子IL-10相对表达水平则明显低于对照组(P<0.05);Masson染色结果表明,放射组大鼠肺间隔纤维组织沉积显著高于对照组(P<0.05);放射组肺组织TUNEL阳性细胞及促凋亡因子Bax、Caspase-3的mRNA和蛋白水平明显高于对照组,且抗凋亡因子Bcl-2mRNA和蛋白水平显著低于对照组(P<0.05);放射组大鼠肺组织PKR蛋白表达水平明显低于对照组,而p-PKR蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05);实验结果表明,PKR敲低细胞照射组细胞生存率、PKR蛋白和抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达显著低于正常细胞照射组,而促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达显著高于正常细胞照射组(P<0.05);PKR过表达细胞照射组细胞生存率、PKR蛋白和抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达显著高于正常细胞照射组,而促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达显著低于正常细胞照射组(P<0.05)。结论:放射可以导致严重的肺损伤,肺损伤发生机制可能与PKR通路有关。

丙型肝炎病毒核心蛋白对双链RNA依赖蛋白激酶活性的影响

目的探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白对双链RNA依赖的蛋白激酶（PKR）活性的影响。方法将表达HCV核心蛋白的真核表达质粒pCMH6K—Core转染人肝癌细胞系BEL-7402，应用干扰素（IFN）。α-2b诱导内源性PKR的表达及活化，利用Western blot检测核心蛋白对PKR磷酸化的影响；将荧光素酶质粒pGL3-Promoter与不同剂量的pCMH6K—Core共转染BEL-7402细胞，进行荧光素酶活性检测，以反映核心蛋白对细胞蛋白合成的影响。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间均数比较用t检验或单因素方差分析。结果在IFNα-2b刺激下，表达HCV核心蛋白的BEL-7402细胞中，PKR的磷酸化水平明显低于空白质粒转染组和未转染组，而3组总PKR的表达水平无明显差别。在共转染荧光素酶质粒与核心蛋白表达质粒的BEL-7402细胞中，荧光素酶活性较共转染空白质粒组增强，且荧光素酶潘性的增高与核心蛋白的表达量呈剂量依赖效应，0．5μg、1．0μg和1．5μg的pCMH6K-Core转染组荧光素酶活性分别为空白质粒组的（1．941士0．199）倍、（2．868±0．275）倍和（3．839±0．338）倍，各组比较，P值均＜0．05。结论在人肝癌细胞系BEL-7402中，HCV核心蛋白能够抑制内源性PKR的活性，从而促进细胞蛋白合成。

长非编码RNA RLM通过影响AMPK的磷酸化调节HepG2细胞中的脂质沉积

长非编码RNAs(long noncoding RNAs,lncRNAs)是一类长度大于200 nt、不能编码蛋白质的RNA分子,可通过AMPK、胰岛素受体等多种信号通路,调节细胞糖脂代谢。本研究发现,HepG2细胞中一条未报道的长链非编码RNA,命名为lnc-RLM(lnc-regulate lipid metabolism)。通过敲低HepG2细胞中lnc-RLM,检测细胞中甘油三脂含量及脂质代谢相关调节因子表达量。结果显示,实验组较对照组甘油三酯含量显著升高(P<0.05);AMPK磷酸化水平显著下调,脂质合成相关因子SREBP 1c和FAS表达量上调;同时,细胞中乙酰辅酶A羧化酶(ACC)活性较对照组显著上调(P<0.05)。在lnc-RLM敲低的HepG2细胞中,利用AMPK激动剂(A-769662)作用细胞24 h,结果显示,降低的AMPK磷酸化水平并不会因AMPK激动剂的作用而显著升高。本研究结果说明,HepG2细胞中敲低lnc-RLM表达量,可通过影响AMPK磷酸化水平,调节HepG2细胞中脂质沉积。这为今后研究AMPK活性调节提供新的可能,也为代谢性疾病的治疗提供了新思路。

siRNA-ID-1对人肝癌细胞HepG2中ERK信号通路的影响

目的观察si RNA-ID-1转染人肝癌细胞HepG2细胞后对肝癌细胞系HepG2细胞增殖的影响及其对ERK1/2通路的作用。方法实验分为4组,即空白对照组、转染试剂组、转染对照组及转染si RNA-ID-1组。阳离子脂质体法介导si-ID-1转染肝癌细胞后,唑蓝比色法(MTT)观察HepG2细胞增殖情况。分别用反转录聚合酶链式反应法(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测转染后p-ERK1/2、ERK1/2 mRNA与蛋白表达的情况。结果转染si RNA-ID-1的HepG2细胞增殖速度明显减慢(P<0.01)。转染后ERK1/2及p-ERK1/2 mRNA表达降低(P<0.01);p-ERK1/2蛋白的表达较空白对照组明显降低(P<0.05),ERK1/2蛋白表达空白变化不明显。结论si RNA-ID-1转染HepG2细胞后可明显抑制细胞的增殖,使得ERK1/2基因表达活性下降,提示ID-1有可能通过ERK1/2信号转导通路介导,促进肝细胞癌HepG2细胞的增殖。