GFAP启动子调控的双顺反子真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27的构建及表达分析

目的构建并鉴定带GFAP启动子的Flag-p27和EGFP双顺反子真核表达载体,观察其表达。方法利用IRES和GFAP启动子,通过质粒抽提、琼脂糖凝胶电泳、酶切、连接、转化等多种基因工程技术,经多步亚克隆后完成能同时表达p27和EGFP基因的星形胶质细胞特异性真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27。转染体外培养的星形胶质细胞,观察EGFP的表达,并通过免疫荧光细胞化学技术观察p27的表达。结果经酶切鉴定和测序鉴定,成功构建真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27。转染星形胶质细胞后可见EGFP的表达,并且在EGFP阳性的细胞中P27表达水平明显增高。结论GFAP启动子能启动目的基因p27和EGFP在星形胶质细胞的表达,连于Flag-p27的下游EGFP可作为报告基因,指示p27的表达情况。带启动子GFAP的Flag-p27和EGFP双顺反子真核表达载体的构建为进一步研究星形胶质细胞增生与神经系统疾病的关系,并为寻找神经系统疾病的有效基因治疗途径奠定基础。

NF-κB启动子调控的pNF-κB-IRES2-EGFP-p27双顺反子真核表达载体的构建及表达分析

目的构建并鉴定携带核转录因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)特异性启动子的Flag-p27和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)双顺反子真核表达载体pNF-κB-IRES2-EGFP-p27,转染经H2O2干预的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),观察其表达。方法采用基因工程技术,经过多步亚克隆后完成能同时表达p27和EGFP基因的NF-κB特异性启动子双转基因真核表达载体。转染体外培养的经H2O2干预的HUVEs,观察EGFP的表达,并通过免疫荧光细胞化学技术观察p27基因的表达。结果经酶切鉴定和测序鉴定,成功地构建真核表达载体pNF-κB-IRES2-EGFP-p27,转染经H2O2干预的HUVEs后,可见部分细胞有EG-FP的表达,并且在EGFP阳性的细胞中p27基因的表达水平明显增高,而未经H2O2处理的对照组转染pNF-κB-IRES2-EGFP-p27后无EGFP的表达。结论NF-κB启动子能够特异性地激活p27基因的表达。EGFP基因可以指示p27基因的表达情况。由NF-κB特异性启动子启动的p27和EGFP双顺反子真核表达载体的构建为进一步研究细胞周期调控与慢性移植物失功(chronic graft dysfunction,CGD)之间的关系,并为进一步寻找慢性移植物失功的基因治疗途径奠定基础。

组织因子途径抑制因子/绿色荧光蛋白双顺反子真核表达载体构建及其在NIH 3T3细胞中表达

目的构建含人组织因子途径抑制因子(TFPI)和绿色荧光蛋白(GFP)基因的双顺反子真核表达载体,并验证其在NIH 3T3细胞中的表达,为血管再狭窄的防治提供一个具有示踪和治疗双重作用的有效载体。方法以含有全长cDNA的pIRES-TFPI为模板,多聚酶链反应(PCR)扩增TFPI全长cDNA,经酶切后插入到pIRES2-AcGFP1-Nuc载体中,构建成双顺反子真核表达载体,重组质粒经酶切图谱分析、PCR扩增及测序鉴定后命名为pIRES2-AcGFP1-Nuc-TFPI。将其转染NIH3T3细胞,采用荧光显微镜观察GFP在细胞中的表达,以RT-PCR检测TFPI在细胞内的表达。结果经酶切图谱分析、PCR扩增及DNA测序证实双顺反子真核表达载体构建正确;荧光显微镜可观察到细胞内GFP的表达;RT-PCR证实经TFPI基因转染的细胞内TFPI mRNA表达增高。结论成功构建了包括TFPI和GFP的真核双表达载体,并使其在NIH3T3细胞中顺利表达。

一个包含HCVIRES的高效真核双顺反子表达载体的构建

In this paper, a new eukaryotic bi-cistronic expression vector containing Hepatitis C Virus(HCV) internal ribosome entry site (IRES) expressing two foreign genes from one mRNA was constructed. The sequence starting from the 5’ untranslated region of 18nt to 32nt in HCV core coding region was cloned and then the encephalomyocarditis virus (ECMV) IRES sequence in the commercial vector pIRES was substituted to construct a new vector pCVIR. Green fluorescent protein (GFP) and Hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) coding genes were inserted up-stream and down-stream of IRES sequence. The fluorescence intensity of GFP and HBsAg were determined by flow cytometry and ELISA respectively., thus, the expression efficiency of the two vectors, pCVIR and pIRES could be compared. The experimental results showed that the vector pCVIR could translate the GFP and HBsAg genes down-stream of its HCV IRES sequence more efficiently without impairing the expression of genes up-stream of IRES sequence than the vector pIRES.It is concluded that a new eukaryotic bi-cistronic expression vector containing HCV IRES was constructed successfully by the method described above.

HLA-C和HLA-G基因真核细胞双表达载体的克隆及鉴定分析

目的 构建人HLA C和HLA G基因真核细胞双表达载体。方法 用RT PCR从孕妇蜕膜组织有核细胞总mRNA中逆转录扩增全长HLA C和HLA GcDNA ,首先将HLA G经BamHⅠ和ClaⅠ双酶切 ,HLA C经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后 ,分别定向插入真核细胞双顺反子载体pVITRO2的多克隆位点 1(mcs1)和 2 (mcs2 )中 ,然后经酶切和测序鉴定 ,确定已建立pVITRO2的单表达质粒pVITRO2 HLA G和pVITRO2 HLA C ,再将HLA CcDNA经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切 ,定向插入单表达质粒pVITRO2 HLA G的多克隆位点 2 (mcs2 )中 ,经PCR反应初筛 ,再经双酶切鉴定。结果 限制性内切酶和测序分析表明已成功构建了HLA Cw 0 10 3和HLA G 0 10 1的单表达质粒pVITRO2 HLA C和pVITRO2 HLA G以及双表达质粒pVITRO2 HLA CG。结论 本研究成功构建了真核细胞双顺反子载体pVITRO2的双表达质粒pVITRO2 HLA CG ,以及单表达质粒pVITRO2 HLA C和pVITRO2 HLA G。

原核双顺反子表达载体——提高基因表达载体通用性的一个尝试

克隆基因的表达无论在分子生物学研究或生物工程生产应用上都是十分重要的。基因表达的真核系统有许多原核不能替代的优点、且近年研究有长足的发展。但原核、特别是大肠杆菌系统有几十年的研究基础,其基因表达的规律已经比较清楚,又有许多可供选择的表达元件、宿主菌株和已构建好的表达载体。

人血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1双顺反子表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的尝试构建人血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX-1)基因双顺反子表达载体并检测其在293T细胞中的表达情况和生物学活性,为深入探讨LOX-1在动脉粥样硬化中的作用和以LOX-1为靶点建立干预机制治疗动脉粥样硬化奠定基础。方法首先根据Primer5.0软件设计引物,采用聚合酶链反应法以LOX-1 c DNA片段为模板扩增LOX-1基因完整编码区,克隆至T载体,经测序成功后亚克隆到双顺反子真核表达载体p IRES2-Ac GFP1-Nuc。利用脂质体转染法将双顺反子重组表达质粒转染至293T细胞,倒置荧光显微镜检测质粒转染情况。采用逆转录聚合酶链反应和免疫印迹法鉴定LOX-1基因在核酸和蛋白水平的表达,采用激光共聚焦检测LOX-1基因在293T细胞膜上的表达,激光共聚焦和流式细胞术检测表达在293T细胞膜上的LOX-1结合氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的生物学活性。结果成功构建p IRES2-LOX-1双顺反子重组表达载体,将其转染293T细胞后,观察到绿色荧光蛋白基因的表达,初步表明LOX-1基因转染至293T细胞。进一步分子水平鉴定结果表明LOX-1基因在293T细胞核酸和蛋白水平均得到表达,激光共聚焦结果证明LOX-1基因在293T细胞膜上表达。最后激光共聚焦和流式细胞术结果证实表达在293T细胞膜上的人LOX-1基因可以结合氧化型低密度脂蛋白。结论成功构建人LOX-1基因双顺反子表达载体,在此基础上证明其在293T细胞膜上得到表达,并且具有结合ox-LDL的生物学活性,为后续体外研究其在动脉粥样硬化中的作用以及以此为靶点建立干预机制奠定了基础。

人工构建含丙型肝炎病毒核糖体插入位点的双顺反子表达载体

目的:研究丙型肝炎病毒核糖体插入位点启动翻译蛋白质功能,构建双顺反子真核表达载体.方法:逆转录PCR(RT-PCR)扩增丙型肝炎基因组中核糖体插入位点序列(IRES),定向克隆到pcDNA3-S质粒多克隆酶切位点中。在IRES下游克隆乙型肝炎病毒核心基因,测序鉴定后获得的质粒经脂质体转染hepG2细胞,间接免疫荧光染色和Western-blot检测.结果:在间接免疫荧光染色后,荧光显微镜下可见已型肝炎病毒S基因和核心基因表达。转染细胞破碎后免疫沉淀检测和图像分析表明,两种基因有相似的表达量。结论:人为截断HCV 5’NTR区17个碱基,并不影响IRES对下游基因蛋白质翻译,为成功构建了含丙型肝炎病毒IRES的双顺反子表达载体打下基础。

一种双顺反子表达载体的构建及应用的研究

将表达载体ｐＥＣ３４中的一段寡核苷酸序列，其中包括翻译增强子序列、ＳＤ序列、终止码、起始码及两端的限制性内切酶位点，插入ＧＳＴ基因后，构建成双顺反子的表达载体．利用此载体表达了非融合的人骨形成蛋白２Ａ（ｈＢＭＰ２Ａ）和人骨形成蛋白３（ｈＢＭＰ３）Ｃ端肽段，将第一顺反子基因（ＧＳＴ基因）切小到原来的１／３时，则位于下游的第二顺反子基因编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达量增加一倍。

猪γ-干扰素双顺反子表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

提取经 Con A诱导培养的猪外周血白细胞总 RNA,RT- PCR扩增出猪 IFN- γ基因并克隆到 p GEM- T- easy载体 ,测序结果表明 ,扩增片段为含有信号肽的猪 IFN-γ完整基因。亚克隆猪 IFN-γ成熟蛋白编码基因 ,并对其 5′段前 2个稀有密码子进行大肠杆菌偏嗜性改造。通过引入 SD序列 ,成功构建了猪 IFN- γ原核双顺反子表达载体 p L CS-po IFN2 G,并实现了猪 IFN-γ在大肠杆菌中的高表达 ,约占菌体总蛋白的 5 6 .5 %。表达产物以包涵体形式存在 ,用含 7mol/L 盐酸胍的变性液溶解及含 0 .5 mol/L盐酸胍复性液复性处理 ,复性后的表达产物经凝胶层析纯化后 ,细胞病变抑制法测定结果表明 ,重组猪

原核真核双表达加强型绿色荧光蛋白质粒的构建

将原核启动子 Ptrc和加强型绿色荧光蛋白 ( EGFP)基因从 EGFP原核表达质粒 p YA3 3 3 4-EGFP上切下 ,然后将其插入至真核表达质粒 p VAX1真核启动子 Pcmv的下游 ,构建成具有真核和原核启动子的双表达杂合质粒 p VAXD-EGFP,其长度为 3 82 3 bp。将 p VAXD-EGFP分别转化鼠伤寒沙门氏菌 X45 5 0和转染 COS-7细胞 ,应用流式细胞术、可见光谱扫描、SDS-PAGE测定 EGFP原核表达 ;应用荧光显微镜观察 EGFP在 COS-7细胞内的表达。重组鼠伤寒沙门氏菌 X45 5 0 ( p VAXD-EGFP)表达 EGFP的量与仅以原核方式表达 EGFP的 X45 5 0 ( p YA3 3 3 4-EGFP)相当 ;将质粒p VAXD-EGFP转染 COS-7细胞 ,EGFP可在 COS-7细胞核和胞浆表达 ,在荧光显微镜下发出强烈荧光。结果表明 :不仅成功地构建原核、真核表达集中于同一质粒的新型质粒 p VAXD-EGFP,而且原核、真核目的蛋白表达量达到很高水平 。

鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因重组真核表达载体的构建

将已经序列测定的鸡传染性支气管炎病毒 ( IBV) HB株的核蛋白基因亚克隆到表达载体 pc DNA3的Kpn 酶切位点 ,快速筛选鉴定出含有 HB核蛋白基因的重组质粒 ,经酶切、PCR及 Southern鉴定为正向插入了 HB核蛋白基因 ,将其命名为 pc DNA-N。对重组质粒进行大量扩增 ,应用聚乙二醇纯化后 ,对 SPF雏鸡进行了免疫攻毒试验 ,结果表明 ,IBV核蛋白在抗感染和抗致死方面具有一定的作用。

小鼠T-bet基因真核表达载体的构建

目的构建小鼠T—bet基因重组真核表达载体pcDNA3一T—bet,为T—bet基因治疗研究提供有效的生物表达系统。方法采用内切酶切从质粒T—bet/GFP—RV中获得约1.7 kb的小鼠T—betcDNA片段,以单酶切非定向克隆方式与真核表达质粒pcDNA3连接,构建真核表达载体pcDNA3-T-bet。结果经PCR筛选阳性重组子,双酶切鉴定T—bet基因重组方向,并测序鉴定无错配及插入移位等DNA顺序改变。结论本实验成功构建了小鼠T—bet基因真核表达载体pcDNA3-T-bet。

重组FN多肽真核表达载体pCH510衔接化疗治疗小鼠肿瘤的研究

目的 :研究肿瘤化疗后转染 pCH5 10质粒是否提高疗效 ,以及二者衔接是否需要特定的条件。 方法 :采用瘤细胞接种建立小鼠肿瘤模型 ;通过基因转染 ,观察 pCH5 10对不同接种量所形成的小鼠肿瘤的抑制作用以及小鼠肿瘤化疗后立即进行pCH5 10转染的抑瘤效果 ;采用细胞培养技术 ,观察小鼠体内注射化疗药物后 ,其对小鼠腹腔巨噬细胞和脾淋巴细胞激活功能的影响 ;采用细胞计数的方法 ,观察化疗药物所致小鼠腹腔巨噬细胞和外周血免疫细胞数量变化的动力学 ;另外小鼠肿瘤化疗后第5天进行pCH5 10转染 ,观察抑瘤效果。结果 :转染pCH5 10对不同接种量形成的小鼠肿瘤生长都有抑制作用 ,并呈负相关。化疗药物可使免疫细胞代谢降低 ,活化受阻 ,在化疗后第 3天免疫细胞数降至最低 ,约 10d左右恢复正常 ;化疗后立即连续 10d转染 pCH5 10质粒 ,疗效没有增强 ;化疗 5d后 ,再连续 15d转染 pCH5 10质粒 ,则疗效明显增强。 结论 :化疗后转染 pCH5 10质粒 ,对小鼠肿瘤治疗效果更好 ,但由于化疗既降低免疫细胞数量 ,又抑制其功能 ,化疗后立即转染pCH5 10质粒是不恰当的 ,并且转染治疗时间不宜过短。pCH5 10、化疗和化疗 +pCH5 10三者对肿瘤不同抑制特点的比较显示化疗具有两面性 ,既抑瘤又促瘤。

鼠肌肉转录调节因子MyoD基因真核表达载体的构建

目的 构建肌肉转录调节因子 Myo D基因真核表达载体 ,为深入研究 Myo D在肌肉修复中的分子调节机制 ,探讨其在肌肉损伤方面的生物学行为 ,为临床应用提供物质基础。方法 含 Myo D c DNA的质粒PEMMBC2 β5于大肠杆菌 E.Coli DH5 a内扩增 ;提取及纯化 PEMMBC2 β5质粒 ;经 DNA序列分析含 Myo Dc DNA;限制性酶切 Myo D c DNA片段 ,连接酶连接到真核表达质粒 pc DNA3- neo内 ,克隆出真核表达载体pc DNA3/ Myo D。结果 提取及纯化的 PEMMBC2 β5质粒含有大小正确的 Myo D c DNA碱基片段 ,其碱基序列为编码目的基因的正确序列 ,凝胶电泳结果证明已将此片段正确地克隆到 pc DNA3/ Myo D内。结论 成功的构建了Myo D基因的真核表达质粒 pc DNA3/ Myo D。

重组SEA基因真核表达载体的构建及诱导小鼠抗肝癌免疫的效应

目的 构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)真核表达载体 ,并通过体内转染 ,观察其诱导抗小鼠肝癌的免疫效应。方法采用基因工程技术构建SEA基因的真核表达载体 ,使其表达SEA分子。通过阳离子脂质体介导的体内转染 ,观察其对小鼠肝癌的治疗作用。用51 Cr释放法测定治疗组与对照组动物脾淋巴细胞杀伤H2 2 细胞的活性。结果成功地构建了SEA真核表达载体 pLXSN SEA ,体内转染 pLXSN SEA的荷瘤小鼠肿瘤明显缩小 ,生存期延长 ,4 10小鼠肿瘤完全消退 ,且长期无瘤生存。CTL杀伤活性实验表明 ,瘤区内转染pLXSN SEA可诱导强烈的CTL杀伤效应 ,与对照组相比较差异显著 (P <0 .0 1)。结论超抗原SEA体内转染对肿瘤具有明确的治疗作用 。

单羧酸转运泵基因反义真核表达载体的构建

目的 构建单羧酸转运泵基因反义逆转录病毒真核表达载体。方法 应用RT PCR方法扩增带有双酶切位点的单羧酸转运泵目的基因片段 ,与带有相同酶切位点的pLXSN逆转录病毒真核表达载体粘末端进行反向基因插入连接 ,构建具有反义表达的逆转录病毒载体。结果 构建载体进行双酶切电泳分析及插入片段基因序列分析 ,证明反义载体构建成功。结论 应用RT PCR方法扩增插入DNA片段 ,简单、灵活、快捷。双酶切定向连接构建反义表达载体可实现构建一步到位 ,免去正反向筛选的麻烦。

带绿色荧光蛋白标签的人era真核表达载体的构建及人Era对细胞形态和细胞周期的影响

目的 :构建人era真核表达载体并初步研究这一人类新基因对体外培养细胞形态和细胞周期的作用。方法 :构建带绿色荧光蛋白 (EGFP)标签的人era真核表达载体 ,转染体外培养细胞NIH3T3,用荧光显微镜观测和流式细胞仪进行分析。结果 :无论EGFP融合于人Era的C端或N端 ,融合蛋白均表达于细胞浆接近核膜处 ,细胞形态无明显变化 ,细胞周期检测S期细胞所占百分数降低。结论 :人era可能参与细胞周期调控 ,为阐明人era的功能提供了资料。

鼠骨骺增殖区细胞的分离鉴定和克隆构建PTHrp基因真核表达载体

[目的]分离、鉴定大鼠骨骺生长板增殖区软骨细胞,克隆甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrp)基因并构建真核表达载体pEGFP-IRES2-PTHrp。[方法]Percoll不连续密度梯度离心法分离生长板增殖区软骨细胞,用X型胶原抗体和电镜鉴定,提取总RNA,RT-PCR方法获得PTHrp基因的全长cDNA,插入pCR2·1TA克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pEGFP-IRES2。[结果]分离出增殖区软骨细胞,经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒。[结论]准确分离增殖区软骨细胞并成功构建了PTHrp基因的真核表达载体,为进一步揭示PTHrp的生物学功能及其在在软骨细胞的分化和骨骼形态发生中的作用奠定了基础。

pCDNA3-AADC真核表达载体的构建及其在原代培养骨骼肌细胞中的表达

目的 将人类神经元性芳香族氨基酸脱羧酶（AADC）基因构建于含CMV启动子的真核表达载体pCD-NA3上,并检测其在原代培养骨骼肌细胞中的表达。方法 采用分子克隆技术将经测序证实的人神经元性AADC基因片段同真核表达载体pCDNA3连接,酶切鉴定并筛选出正向连接重组体,并采用脂质体转染法将其导入原代培养的骨骼肌细胞,免疫印记检测该基因的表达。结果 酶切证实基因片断正向连接于pCDNA3上,并在原代骨骼肌细胞中获得表达。结论 含人类神经元AADC基因的真核表达重组体可在原代培养的骨骼肌细胞中有效的表达。