双顺反子质粒DNA疫苗的研究

肿瘤疫苗是转移性癌化疗的有希望的替代品。为达到有效而安全，治疗性癌苗应特异性靶向转移性肿瘤细胞上表达的抗原。抗非何杰金氏B细胞淋巴瘤表达的特异性表面免疫球蛋白或其独特型的疫苗，它符合这些标难，因为原发的或转移的肿瘤细胞皆表达肿瘤特异性免疫球蛋白。使用小鼠38C13B细胞淋巴瘤作为一种模型系统设计了一种质粒DNA疫苗，它表达编码38C13肿瘤表面轻链和重链两种肿瘤免疫球蛋白(独特型)的双顺反子mRNA。为提高该质粒DNA疫苗的免疫原性，将小鼠轻重链的可变区与其人免疫球蛋白相应的稳定区相融合。另外，构建的真核类表达盒在体内得产生鼠／人嵌合型免疫球蛋白的高水平表达，及引起保护性免疫应答。用特有的SfiI限制位点快速克隆任一肿瘤特异的免疫球蛋白独特型区，产生的系列质粒构建物用以试验J区和／或人C区插入SfiI限制位点的差异，发现这样的差异对表达和免疫原性都有显著影响。原型独特型疫苗免疫小鼠产生了抗38C13肿瘤的保护性免疫应答。研究表明，双顺反子质粒DNA为基础的新疫苗可用于开发抗B细胞淋巴瘤的肿瘤特异性疫苗。

双顺反子表达质粒在DNA疫苗研究中的应用

简述了DNA疫苗的研究概况,介绍了真核双表达质粒的结构特点及其在基因佐剂和二价DNA疫苗中的应用情况,总结分析了双表达质粒的优点和存在的问题,并对其今后在DNA疫苗中的研究方向和前景进行了展望。

IBV S1基因和IL-2基因双顺反子DNA疫苗的免疫原性研究

为了研制更加有效的IBV DNA疫苗,将IBV的S1基因和禽白介素2(IL-2)基因插入双顺反子表达载体pIRES-EGFP/DsRed中,构建能分别或同时表达S1基因和IL-2基因的pIRES-S1、pIRES-IL2、pIRES-S1/IL-2质粒。通过脂质体转染Vero细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测表达。将构建的质粒用脂质体包裹后,通过腿部肌肉多点注射免疫7日龄雏鸡,二免后两周用IBV肾型强毒进行攻毒。结果表明,pIRES-S1/IL-2在体外能够诱导Vero细胞表达S1蛋白和IL-2;pIRES-S1/IL-2和pIRES-S1+pIRES-IL2免疫雏鸡后均能促进外周血T淋巴细胞亚群数量和血清中特异性抗体水平的增加,能明显增强IBV DNA疫苗对同型强毒的攻击保护,但pIRES-S1/IL-2免疫组要优于pIRES-S1+pIRES-IL2混合免疫组及其它对照组,差异显著或极显著。以上结果表明禽IL-2能同时加强DNA疫苗的细胞免疫和体液免疫应答;但抗原基因和IL-2共表达DNA疫苗的免疫效果明显要优于混合注射的DNA疫苗。

治疗性双质粒HBV DNA疫苗制品中SDS残留量的测定

目的应用吖啶橙分光光度法来检测HBVDNA疫苗双质粒制剂中的十二烷基硫酸(sodium dodecyl sulfate,SDS)残留量。方法将SDS标准品按不同浓度与吖啶橙混合作用后,经甲苯萃取,再测定A499值,制定出相应的标准曲线。根据待测样品的A499值,求出其SDS浓度。结果SDS浓度在0～0.0032%的范围内,线性关系良好,相关系数r>0.99,而SDS浓度在0～0.0064%的范围,曲线的相关系数r仅为0.96。因此,应采用在0～0.0032%的范围的标准曲线。待测样品三批制剂的SDS残留量均小于0.002%,表明制剂的SDS残留合格,检测结果稳定可靠。结论建立了检测HBVDNA疫苗双质粒制剂中SDS残留量的实验方法,为进一步的终产品质量控制及后续的实验研究奠定了基础。

原核真核双表达加强型绿色荧光蛋白质粒的构建

将原核启动子 Ptrc和加强型绿色荧光蛋白 ( EGFP)基因从 EGFP原核表达质粒 p YA3 3 3 4-EGFP上切下 ,然后将其插入至真核表达质粒 p VAX1真核启动子 Pcmv的下游 ,构建成具有真核和原核启动子的双表达杂合质粒 p VAXD-EGFP,其长度为 3 82 3 bp。将 p VAXD-EGFP分别转化鼠伤寒沙门氏菌 X45 5 0和转染 COS-7细胞 ,应用流式细胞术、可见光谱扫描、SDS-PAGE测定 EGFP原核表达 ;应用荧光显微镜观察 EGFP在 COS-7细胞内的表达。重组鼠伤寒沙门氏菌 X45 5 0 ( p VAXD-EGFP)表达 EGFP的量与仅以原核方式表达 EGFP的 X45 5 0 ( p YA3 3 3 4-EGFP)相当 ;将质粒p VAXD-EGFP转染 COS-7细胞 ,EGFP可在 COS-7细胞核和胞浆表达 ,在荧光显微镜下发出强烈荧光。结果表明 :不仅成功地构建原核、真核表达集中于同一质粒的新型质粒 p VAXD-EGFP,而且原核、真核目的蛋白表达量达到很高水平 。

结核杆菌Esat6与hGM-CSF双顺反子表达载体的构建及鉴定

目的从质粒pVAE中克隆目的基因Esat6,与hGM-CSF一起构建双顺反子表达载体pIEG,并进行鉴定。方法以质粒pVAE为模板扩增出Esat6基因,与pIRES的MCS A进行重组,构建pIEsat6重组质粒。然后再以pORF-hGM-CSF为模板扩增出hGM-CSF基因,与pIRES载体的MCS B进行重组,构建pIGM重组质粒,上述两重组质粒经PCR、限制性内切酶图谱及DNA序列测定分析等多种方法进行鉴定后,再通过酶切、连接把hGM-CSF构建于pIEsat6质粒中,形成双顺反子真核表达载体pIEG。结果通过PCR可克隆得到相应大小的产物,酶切鉴定所切下的两片段大小约为0.29 kb和0.47 kb,与预计相符。测序结果与报道一致。结论成功构建结核杆菌Esat6基因与hGM-CSF双顺反子真核表达载体,为进一步研究其结核融合DNA疫苗及其转染DC疫苗原型的免疫保护效果奠定了基础。

IL-2与猪瘟病毒E_2基因真核双表达载体的构建及其免疫增强作用的研究

应用DNA重组技术构建了猪瘟病毒E2 基因与IL 2基因的双表达真核表达载体 ,观察其表达水平 ,并对其免疫增强效果进行了观察。结果是构建了猪瘟病毒E2 基因与白细胞介素 2的真核表达质粒pIRSTIL 2。将质粒转染BHK 2 1细胞 ,可在体外表达E2 和有生物活性IL 2。pIRSTIL 2质粒能诱导产生CSFV的特异性免疫反应。pIRSTIL 2所诱导的免疫应答反应比使用单表达质粒pIRST强。实验表明 :IL 2与猪瘟病毒E2

治疗性双质粒HBV DNA疫苗制剂的稳定性

目的考察治疗性双质粒HBV DNA疫苗制剂A、B的稳定性。方法按照《中国药典》三部(2010版)方法,对治疗性双质粒HBV DNA疫苗制剂A、B分别进行影响因素试验、加速试验、长期试验,在不同条件下考察样品的基本性状,特别检测质粒DNA的超螺旋比例及进行细胞学转染试验和体内药效学试验。结果双质粒HBV DNA疫苗制剂在破坏性因素的影响下,于光照(4 500±500)Lx、高温(40和60℃)、反复冻融(-20℃←→4℃和-20℃←→RT)条件下5 d均不稳定;匀速振动(140和240 r/min)10 d不稳定;在(25±2)℃、相对湿度(60±10)%的条件下放置1个月不稳定;在温度2~8℃条件下放置2年保持稳定。结论双质粒HBV DNA疫苗制剂对光照、温度敏感,应避光低温保存,避免反复冻融,适合现代快速长途运输,长期保存应在2~8℃条件下,暂定二年有效期,为治疗性双质粒HBV DNA疫苗的临床用样品的运输和保存提供了依据。

HBs和HCVc基因双顺反子质粒在BALB/c小鼠体内的分布

采用注射含双顺反子质粒后,PCR法扩增不同组织中HBsAg和HCVc基因,同时检测HBV和HCV抗体应答水平.研究注射基因免疫用双顺反子质粒在小鼠组织中的分布.pcDNA3.0BApc154S2S 1次注射BALB/c小鼠后,24 h内主要分布于血液、肝、脾、骨髓、淋巴结、注射部位肌肉、肺和肾等含血液丰富的组织中.注射后2 d主要在骨髓、血液和注射部位肌肉中存在.7 d后仅在注射部位肌肉中能检测出来,并可持续到第9周.组织切片镜检质粒注射初期肌肉细胞轻度浊肿,随后肌膜细胞轻度增生,未见其它明显的组织病理学变化.质粒多次免疫BALB/c小鼠未见明显的临床症状和病理组织学变化.质粒在小鼠体内不同组织存在时间不一致.