表达mFasL的新型双顺反子逆转录病毒基因转移体系的建立

为建立表达小鼠 Fas配体 (m Fas L)的内部核糖体进入位点 (IRES)串联的双顺反子新型逆转录病毒基因转移体系 ,用基因重组技术将 m Fas L c DNA基因构建到 IRES双顺反子逆转录病毒载体 (PL XIN)中 ,脂质体法将此重组质粒 PL FIN和空载体 PL XIN分别转染包装细胞 (PA317) ,经 G418筛选出抗性包装细胞克隆 ,基因组 DNA PCR测定基因整合情况。并将抗性 PA317克隆培养上清感染小鼠成纤维细胞系 (NIH3T3) ,筛选出高滴度的 PA317细胞系 ;用流式细胞术测定筛选的 NIH3T3细胞目的基因表达状况 ;以抗性 NIH3T3和 Fas+Yac- 1细胞共培养法检测目的基因的生物学活性。筛选出 12个 PL FIN转染的 PA317细胞克隆中 ,最高产毒效价为 8.5× 10 5CFU(colony- form ing- unit) ;经此上清感染、筛选出的 NIH3T3细胞 ,高表达 m Fas L (阳性率高于对照组 5 2 .5 4% ) ;且能显著诱导 Fas+Yac- 1细胞凋亡 (凋亡率高于对照组 49% )。说明成功建立了表达 m Fas L

逆转录病毒载体pOZ-KLF5的构建及鉴定

为研究KLF5的相互作用蛋白从而深入探索其生物功能,构建了C端带有FLAG、HA、6x His三标签的p OZ-KLF5真核表达逆转录病毒载体。p OZ-KLF5载体可通过一次转录得到双顺反子转录单位,即一个转录物能表达两种独立存在的蛋白质:三标签融合蛋白KLF5-3x Tag和筛选标记——白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)。通过偶联IL-2Rα抗体的磁珠成功筛选出KLF5-3x Tag表达阳性的293T细胞,经Western-blot检测细胞内KLF5-3x Tag表达情况及其对293T细胞增殖及周期的影响,发现KLF5-3x Tag能够促进细胞克隆的形成并使S期细胞增多,且可被已知E3泛素连接酶WWP1降解,与已有报道一致。进一步通过免疫沉淀实验证明了与KLF5融合的标签的免疫反应性。该质粒的成功构建为研究KLF5相互作用蛋白及深入探索其生物功能奠定了基础。