表达mFasL的新型双顺反子逆转录病毒基因转移体系的建立

为建立表达小鼠 Fas配体 (m Fas L)的内部核糖体进入位点 (IRES)串联的双顺反子新型逆转录病毒基因转移体系 ,用基因重组技术将 m Fas L c DNA基因构建到 IRES双顺反子逆转录病毒载体 (PL XIN)中 ,脂质体法将此重组质粒 PL FIN和空载体 PL XIN分别转染包装细胞 (PA317) ,经 G418筛选出抗性包装细胞克隆 ,基因组 DNA PCR测定基因整合情况。并将抗性 PA317克隆培养上清感染小鼠成纤维细胞系 (NIH3T3) ,筛选出高滴度的 PA317细胞系 ;用流式细胞术测定筛选的 NIH3T3细胞目的基因表达状况 ;以抗性 NIH3T3和 Fas+Yac- 1细胞共培养法检测目的基因的生物学活性。筛选出 12个 PL FIN转染的 PA317细胞克隆中 ,最高产毒效价为 8.5× 10 5CFU(colony- form ing- unit) ;经此上清感染、筛选出的 NIH3T3细胞 ,高表达 m Fas L (阳性率高于对照组 5 2 .5 4% ) ;且能显著诱导 Fas+Yac- 1细胞凋亡 (凋亡率高于对照组 49% )。说明成功建立了表达 m Fas L

逆转录病毒载体介导的转基因鸡研究进展

转基因鸡作为重要的经济动物和理想的生物反应器,具有广阔的应用前景。鸡基因组测序的完成加快了转基因鸡的研究和发展。病毒载体法是转基因鸡制备的主导方法之一,具有效率高和遗传稳定性良好的优势。本文对逆转录病毒载体特征、复制缺陷型病毒载体和复制整合双缺陷型病毒载体的优缺点及其介导的转基因鸡研究进行综述,展望人工核酸酶技术结合复制整合双缺陷型逆转录病毒载体在转基因鸡研究领域的应用前景。

BAALC转录本1-6-8逆转录病毒表达载体的构建

目的构建含BAALC(brain and acute leukemia,cytoplasmic)1-6-8转录本的逆转录病毒表达载体。方法从KASUMI-1细胞株中提取mRNA,应用RT-PCR技术扩增BAALC 1-6-8获得目的基因,选用pMDTM18-TVector做TA克隆。分别双酶切TA克隆获得的阳性质粒和pcDNATM3.1/myc-His A+质粒,琼脂糖电泳纯化回收前者的小片段和后者的大片段,应用T4连接酶连接后转化至E.coliDH5α中。PCR扩增BAALC-myc-His基因序列,双酶切PCR产物和pLXSN载体,T4连接酶连接后转化至E.coliDH5α中,挑选阳性克隆,PCR、双酶切及测序鉴定。结果 PCR分别扩增TA克隆产物和重组pcDNATM3.1/myc-His A+-BAALC,在535bp处均可见一清晰的特异性扩增条带,显示TA克隆及重组真核表达载体成功;PCR扩增pLXSN-BAALC-His大小为664 bp,双酶切及测序结果证实目的基因片段正确插入到逆转录病毒表达载体pLXSN中。结论分离得到了BAALC 1-6-8转录本基因,并成功构建了pLXSN-BAALC-His表达载体。

肝癌双自杀基因逆转录病毒转染体系构建与鉴定

目的 进行肝癌双自杀基因逆转录病毒转移体系的建立及鉴定, 为后续将其转染肝癌细胞、并进行抗肝癌细胞株的功能实验和功效研究奠定基础.方法 采用基因工程的方法, 将pWZLneoC-DglyTK质粒转化到 DH5α 感受态菌后, 提取质粒 DNA, 并采用酶切和 PCR 及 A260 nm 和 A260 nm/A280 nm吸光度测定等方法进行分析鉴定; 再将其质粒DNA用脂质体介导转染PA317 细胞, 然后经G418 筛选阳性克隆, 进行扩增培养PA317/CD+TK细胞, 即成功构建含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶( E. coli CD)和单状疱疹病毒胸苷激酶( HSV-tk)的肝癌双自杀基因逆转录病毒转移体系.结果 转化的阳性菌株可在含Amp的琼脂上生长; 质粒经1%琼脂糖凝胶电泳后可见有质粒 DNA 存在; 经单酶切和双酶切后, 分别显示相应的电泳条带; PCR鉴定可见有扩增出的CD和TK阳性条带, 测定DNA浓度为5. 25 μg/μl, 纯度为1. 81.同时, 两种质粒转入PA317 细胞48 h后荧光显微镜下可观察细胞内有绿色荧光产生, 其转染效率约为20% ~30% ; CD、 TK基因PCR分别扩增, 已整合到PA317 细胞基因组上, 其基因PCR产物的相应处分别有一特异性条带; 将RNA逆转录后进行PCR扩增, CD、 TK基因在 PA317 细胞中得到表达, 其基因RT-PCR产物的相应处也分别有一特异性条带; 另外, 透射电镜下观察到培养液上清液中病毒颗粒散在或聚集成堆, 呈圆球形, 边缘呈波状, 直径约100 nm.结论 采用上述方法并通过分析鉴定结果证实,已成功构建出肝癌双效自杀基因逆转录病毒转移体系, 这将为今后该体系对人类肝癌细胞系的 HepG2 及联合肝癌双效自杀基因前体药物并结合天然抗癌药物共济增效及代谢协同杀伤肝癌细胞奠定治疗物质和方法学基础.

pDC316-hIL-12-IRES-CKb双顺反子重组腺病毒载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的:构建含肌酸激酶(CK)基因和人白细胞介素12(hIL-12)基因的双顺反子重组腺病毒载体pDC316-hIL-12-IRES-CKb,并包装成重组腺病毒,检测其在肝细胞中蛋白表达和肝脏中磷酸肌酸的水平。方法:将PCR扩增的产物CK片段和hIL-12片段顺次插入双顺反子腺病毒载体(IES)中,经同源重组、包装和扩增获得重组腺病毒子。再用该病毒感染体外培养的兔肝细胞,经Western blotting检测到CK蛋白的表达和ELISA检测培养液中hIL-12水平。结果:体外实验在感染肝细胞后检测到CK和hIL-12蛋白的表达;同时体内实验应用核磁共振波谱(MRS)的方法能检测到肝脏特异性CK产物磷酸肌酸的水平。结论:携带CK和hIL-12基因的双顺反子重组腺病毒能使CK基因异源性地表达在肝脏并能用非侵袭性的MRS技术检测其表达。此载体的构建为进一步研究CK基因作为一个影像报告基因动态监测肝脏治疗基因hIL-12的表达奠定基础。

抗肝癌sFv-TNF-α基因逆转录病毒包装细胞系的建立

目的 :将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因 (sFv -TNF -α)克隆至逆转录病毒载体pLXSN ,包装并筛选具有高滴度感染性重组病毒产生细胞系。方法 :用平 -粘末端连接方法将sFv-TNF -α克隆至pLXSN ,磷酸钙共沉淀法转染PA31 7包装细胞并测定病毒滴度 ,用PCR及免疫组化方法分析鉴定重组逆转录病毒细胞系。结果 :成功构建了表达载体pLXSN -sFv-TNF -α ,筛选出一株cfu >1× 1 0 9·L- 1 的感染性重组病毒产生细胞系C2 2 。结论 :外源基因整合到转染细胞DNA中并表达 。

人工构建含丙型肝炎病毒核糖体插入位点的双顺反子表达载体

目的:研究丙型肝炎病毒核糖体插入位点启动翻译蛋白质功能,构建双顺反子真核表达载体.方法:逆转录PCR(RT-PCR)扩增丙型肝炎基因组中核糖体插入位点序列(IRES),定向克隆到pcDNA3-S质粒多克隆酶切位点中。在IRES下游克隆乙型肝炎病毒核心基因,测序鉴定后获得的质粒经脂质体转染hepG2细胞,间接免疫荧光染色和Western-blot检测.结果:在间接免疫荧光染色后,荧光显微镜下可见已型肝炎病毒S基因和核心基因表达。转染细胞破碎后免疫沉淀检测和图像分析表明,两种基因有相似的表达量。结论:人为截断HCV 5’NTR区17个碱基,并不影响IRES对下游基因蛋白质翻译,为成功构建了含丙型肝炎病毒IRES的双顺反子表达载体打下基础。

基于FMDV IRES的双顺反子载体的构建及体外表达分析

利用RT-PCR扩增出口蹄疫病毒小核糖体进入位点(IRES)序列,并定向克隆进pcDNA3.1(+)载体,构建成双顺反子真核表达载体。为了验证该载体是否能够转录出双顺反子mRNA,在IRES起始密码(ATG)下游正确插入增强型的绿色荧光蛋白基因(egfp),把重组质粒转染BHK-21细胞,培养20～48h,在紫外显微镜下观察,能够看到典型的绿色荧光,表明载体能够体能够利用FMDV的IRES能够介导非帽依赖性表达外源基因。并通过流式细胞仪,与同样是CMV启动转录egfp的pGFPN1质粒在细胞中的表达水平进行了比较。该载体的成功构建为体外表达双基因、双顺反子逆转录载体构建以及相关应用奠定基础,并有作为基因疫苗和标记定位基因治疗载体的潜力。

一个包含HCVIRES的高效真核双顺反子表达载体的构建

In this paper, a new eukaryotic bi-cistronic expression vector containing Hepatitis C Virus(HCV) internal ribosome entry site (IRES) expressing two foreign genes from one mRNA was constructed. The sequence starting from the 5’ untranslated region of 18nt to 32nt in HCV core coding region was cloned and then the encephalomyocarditis virus (ECMV) IRES sequence in the commercial vector pIRES was substituted to construct a new vector pCVIR. Green fluorescent protein (GFP) and Hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) coding genes were inserted up-stream and down-stream of IRES sequence. The fluorescence intensity of GFP and HBsAg were determined by flow cytometry and ELISA respectively., thus, the expression efficiency of the two vectors, pCVIR and pIRES could be compared. The experimental results showed that the vector pCVIR could translate the GFP and HBsAg genes down-stream of its HCV IRES sequence more efficiently without impairing the expression of genes up-stream of IRES sequence than the vector pIRES.It is concluded that a new eukaryotic bi-cistronic expression vector containing HCV IRES was constructed successfully by the method described above.

TFR和VEGF基因双顺反子慢病毒感染骨髓内皮祖细胞的研究

目的:研究转铁蛋白受体(transferrin receptor,TFR)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的双基因共表达慢病毒载体是否能介导目的基因在中华小型猪骨髓内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)中的有效表达。方法:通过分子克隆技术构建双顺反子慢病毒表达载体pLenti-GFP-TIR;分离培养中华小型猪骨髓EPCs,用流式细胞仪(FCM)检测细胞表面抗原CD31和Flk-1的表达;并利用Lipofectin 2000将含目的基因的转移质粒与pRsv-REV、pMDlg-pRRE及pMD2G共转染293T细胞并进行慢病毒包装。72 h后,收集病毒上清,感染中华小型猪骨髓EPCs,并通过RT-PCR法检测TFR和VEGF基因的表达。结果:①成功地构建了双顺反子慢病毒表达载体pLenti-GFP-TIR;②FCM检测证实,分离的细胞为骨髓EPCs;包装好的慢病毒颗粒可成功地感染中华小型猪骨髓EPCs;③RT-PCR法检测表明,TFR和VEGF呈高水平的表达。结论:TFR和VEGF基因双顺反子慢病毒载体Lenti-GFP-TIR可有效地转移目的基因至中华小型猪骨髓EPCs中,并成功地表达目的基因,为进一步探讨移植细胞分子成像奠定了基础。

双拷贝逆转录病毒载体介导的NT-3基因在嗅鞘细胞中的表达及其生物学活性

嗅鞘细胞（OEC）作为一种新颖的神经胶质细胞，可促进髓鞘和轴突的再生。神经营养因子-3（NT-3）是神经营养素家族众多成员中最有效的一种，具有强大的诱导神经再生作用。我们曾将OEC联合NT-3注入大鼠侧脑室，发现能较好地促进神经轴突和髓鞘的修复，但遗憾的是NT-3浓度较低，且持续性欠佳。因此，寻找一种内源性、持续性的NT-3供给方法尤为必要。

逆转录病毒载体介导TK/GCV与CD/5FC双自杀基因治疗肝细胞肝癌的研究

目的 探讨TK与CD双自杀基因对肝癌细胞的杀伤作用及旁观者效应 ,并在前药用量、杀伤效力及旁观者效应强弱等方面 ,与单自杀基因比较。方法 将TK与CD双自杀基因导入肝细胞肝癌细胞系HCC 990 3,用不同浓度更昔洛韦 (GCV)及 5氟胞嘧啶 (5FC)、不同混育比例及不同混育时间分别作用于细胞 ,观察在这些条件下的杀伤效应及旁观者效应。结果 GCV与 5FC的有效浓度范围分别是大于 10 -2 μg/ml及大于 2mmol/L ,混育 96h杀伤作用明显高于 2 4h。HCC 990 3/TK +CD细胞占 5 %以上 ,即可观察到旁观者效应。结论 以脂质体介导成功将双自杀基因TK与CD感染肝细胞肝癌细胞系HCC 990 3,双自杀基因具有强大杀伤作用 ,较单自杀基因更为明显 ,其前药用量减少 ,降低了药物的毒副作用 ,旁观者效应更为强大。其杀伤作用与前药浓度、混育比例及混育时间呈正相关。

含I-A^dα和β链cDNA的三顺反子逆转录病毒载体构建及真核表达

为了协同表达MHCII类分子的两个链α和 β ,利用脑心肌炎病毒和脊髓灰质炎病毒的内核糖体进入位点 ,构建了含MHCII类分子α和 β链及选择标记新霉素磷酸转移酶基因的三顺反子逆转录病毒载体。经包装细胞包装成重组逆转录病毒后 ,感染NIH3T3、MM45T Li、COS7细胞 ,经PCR、RT PCR、Southern印迹、Northern印迹及流式细胞术在多水平上证实了α链和 β链的基因表达和MHCII类分子的正确组装。

乙型肝炎病毒表面抗原双顺反子的真核表达载体构建

目的利用双顺反子元件构建含 ＨＢｓＡｇ双体基因的真核表达载体，以增强 ＤＮＡ疫苗的免疫疗效。方法我们首先酶切ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ获得目的基因ＨＢＳＡｇ片段，将其克隆到ｐＣＩ－ｎｅｏ载体得到ｐＣＩ－Ｓ表达载体；另外通过ＰＣＲ扩增获得目的基因ＩＲＥＳ－Ｓ并定向克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｋ＋Ｓ载体，相应酶切后再次克隆到ｐＣＩ－Ｓ得到两价ＨＢｓＡｇ真核表达载体ｐＣＩ－Ｓ－ＩＲＥＳ－Ｓ，并进行酶切图谱分析和测序分析。结果ｐＣＩ－Ｓ－ＩＲＥＳ—Ｓ经相应酶切电泳显示 ７４０ ｂｐ和 １３５０ ｂｐ左右的目的基因片段，经测序鉴定， ＨＢｓＡｇ与 ＧｅｎｅＢａｎｋ ＨＢｓＡｇ ａｄｗ亚型相符，ＩＲＥＳ－Ｓ亦无任何变异。结论乙型肝炎表面抗原双体的双顺反子的真核表达载体构建成功，为在真核细胞的高效表达和基因治疗作了必要的准备。

人乳头瘤病毒6bL1双顺反子载体的构建及其在哺乳动物细胞内的表达

目的构建尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒6b型晚期基因（HPV6bLI）的双顺反子表达载体，并使其在哺乳动物细胞内表达，以期建立含有HPV6bLI的细胞模型。方法表达质粒pEGFP—HPV6bL1经双酶切纯化后与经过相同双酶切的真核表达质粒pIRES2-EGFP连接，酶切鉴定，挑选阳性克隆进行测序。重组质粒pIRES2-HPV6bL1-EGFP转染进小鼠成纤维细胞（NIH3T3），荧光显微镜下观察EGFP蛋白的表达，RT—PCR检测HPV6b L1 mRNA的生成。结果成功构建含HPV6bL1的重组质粒pIRES2-HPV6bL1-EGFP。重组体成功转染进NIH3T3细胞，并用G418筛选。同时荧光倒置显微镜下可观察到细胞内有绿色荧光蛋白的表达。进一步进行RT—PCR，检测到HPV6bL1mRNA的生成。结论成功构建携带HPV6bL1的重组体pIRES2-HPV6bL1-EGFP并转染入NIH3T3细胞。经荧光倒置显微镜观察及RT—PCR方法检测证明HPV6bLI在NIH3T3细胞内成功表达。

hTERT启动子调控的双顺反子载体的构建

目的构建了人端粒酶逆转录酶(human telomerase reserse transcription,hTERT)基因核心启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体。方法提取人SGC-7901细胞的基因组,利用PCR技术克隆hTERT基因核心启动子(hTERTp),并将其插入表达载体pVITRO2中,以bTERTp替换hFerL启动子和hFerH启动子构建hTERTp1-hTERTp2-pVITRO2。用酶切法和测序法鉴定重组载体,RT-PCR法估计载体活性。结果经酶切和测序鉴定,以hTERT基因核心启动子调控的真核表达载体hTERTp1-hTERTp2-pVITRO2构建成功,且只在肿瘤细胞中具有表达活性。结论 hTRET基因核心启动子具有肿瘤特异性,构建hTERT基因核心启动子的载体可能是一种新型和有希望肿瘤治疗的途径。

白细胞介素12对小鼠肝癌基因治疗的实验研究

目的：研究白细胞介素１２对小鼠肝癌细胞基因治疗效果。方法：利用脑心肌炎病毒（ＥＭＣＶ）及脊髓灰质炎（Ｐｏ－ｌｉｏ）病毒内核糖体进入位点（ＩＲＥＳ），连接ｍＩＬ－１２ Ｐ４０及ｐ３５ ｃＤＮＡｓ和筛选基因新霉术磷酸转移酶（ＮｅｏＲ），克隆至逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ中，使三个基因同时受逆转录病毒载体５’端ＬＴＲ启动子控制，转录至同一ｍＲＮＡ转录本上，从而构建成多顺反子逆转录病毒载体，即ｐＧＣＥＮ／ｍＩＬ－１２。在ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ介导下将ｐＧＣＥＮ／ｍＩＬ－１２转染包装细胞ＰＡ３１７，Ｇ４１８筛选，直至出现阳性克隆（命名为：Ｍ４５／ｍＩＬ－１２），挑取抗性克隆，扩大培养，收集上清，用小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３测定病毒滴度。然后用重组逆转录病毒感染小鼠肝癌细胞ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ，Ｇ４１８筛选，直至出现阳性克隆，扩大培养，对阳性克隆进行鉴定。将６０Ｃｏ照射（６０ Ｇｙ）Ｍ４５／ｍＩＬ－１２细胞对荷瘤小鼠进行瘤内接种，每周一次，连续治疗三次，观察其治疗效果。结果：病毒上清中重组逆转录病毒滴度为５×１０~５ＣＦＵ／ｍｌ。 ＰＣＲ及ＲＴ－ＰＣＲ证明外源基因已整合至小鼠肝癌细胞基因组中，以及外源基因在ｍＲＮＡ水平上的表达。

CDglyTK自杀基因系统治疗小鼠慢性粒细胞白血病皮下移植瘤的研究

为了探讨逆转录病毒介导的CDglyTK自杀基因系统对K562细胞的体内外杀伤作用,将逆转录病毒介导的CDglyTK自杀基因转染入K562细胞,体外实验用MTT法观察5-氟胞嘧啶/丙氧鸟苷(5-fluorocytosine/ganciclovir,5-FC/GCV)对K562/CDglyTK细胞的生长抑制率。体内实验时将K562/CDglyTK细胞和K562细胞接种于裸鼠皮下,使用GCV和5-FC后,观察裸鼠肿瘤体积的变化及裸鼠的生存率。体外实验表明,GCV联合5-FC对K562/CDglyTK细胞具有明显的杀伤作用;体内实验结果显示,皮下注射K562细胞和K562/CDglyTK细胞后小鼠成瘤率无明显区别;使用5-FC/GCV可明显抑制裸鼠体内的肿瘤形成;经5-FC/GCV治疗后K562/CDglyTK组的肿瘤体积较对照组明显缩小,裸鼠生存率也较对照组明显提高。结论:双自杀基因在体内外对K562细胞均有杀伤作用。