可去除选择标记的DREB基因双T-DNA载体共转化玉米

通过体外重组构建双T-DNA双元载体pCDMARpWDT-Hyg,选择标记基因hpt(hygromycin phospho-transferase)和抗逆转录因子基因DREB分别位于两个独立的T-DNA。用农杆菌介导法转化玉米胚性愈伤组织,通过在抗性培养基上严格筛选,在获得的再生转化植株中,同时整合hpt基因和DREB基因的共转化率达到26·3%。该转化系统的建立为下一步得到无选择标记的转基因植株奠定基础。此外,本实验还通过gus基因的瞬时表达分析了农杆菌转化玉米的影响因素。

番木瓜β-Gal基因RNAi双T-DNA植物表达载体的构建及其遗传转化的初步研究

克隆了番木瓜(Carica papaya L.)果肉的细胞壁水解关键酶β-半乳糖苷酶(β-GAL)基因保守区,将其反向重复插入载体pKANNIBAL,构建RNAi中间表达载体pKAN/RG,将其上的发夹结构取代经改造的载体pCAMBIA1300上hptⅡ基因,构建中间表达载体p1300-/MFRG,分离单T-DNA区段,与载体pCAMBIA2301构建RNAi双T-DNA植物表达载体p2301/TTRG。酶切分析和PCR检测表明,p2301/TTRG已被成功导入农杆菌EHA105。通过遗传转化,初步获得了GUS染色呈阳性且具Kan抗性的番木瓜胚性愈伤组织。

双T-DNA共转化获得转基因番木瓜

番木瓜采后期间的迅速软化现象,导致果实的货架期十分短暂。利用RNAi-β-Gal双T-DNA植物表达载体p2301/TTRG,通过农杆菌介导,探索了液体振荡转化法和浸泡转化法对番木瓜胚性愈伤组织共转化效率的影响。经抗生素敏感性测定,将卡那霉素筛选质量浓度确定为150mg·L-1。在该质量浓度下,2种方法均获得了转基因再生植株,但转化效率仍较低。正交试验结果表明,浸泡转化法中各处理因素的作用大小为:AS质量浓度>共培养时间=菌液光密度值=侵染时间,最佳共转化组合为:100μmol·L-1AS+菌液光密度值0.2+侵染20min+共培养3d。经PCR和Southern杂交检测,所获得的5株再生植株中有2株为共转化的结果,诱导了其中1株生根并移栽。为进一步选育无选择标记基因的抗软化转基因番木瓜奠定了基础。

利用双T-DNA载体获得无筛选标记的转基因猕猴桃

以美味猕猴桃品种米良1号的当年生嫩枝及叶片为外植体,构建了1个双T-DNA载体pCAMBIA1300-actin-term-2,通过根癌农杆菌EHA105菌株作为介导,将aco反义基因导入米良1号猕猴桃中。通过后代植株的遗传分离,以期获得无潮霉素筛选标记的转基因植株。结果表明,愈伤组织预培养20 d,侵染30 min,EHA105菌液浓度Dnm=0.6,培养5 d,经PCR法检测证明aco反义基因已转入转化植株基因组中。

农杆菌介导的猕猴桃ACO反义基因遗传转化

以猕猴桃米良1号的当年生嫩枝及叶片为外植体,构建了双右边界双元载体pCAMBIA1300-actin-term-2,通过根癌农杆菌EHA105菌株介导,将ACO反义基因导入猕猴桃植株基因组。结果表明,愈伤组织预培养20 d,农杆菌侵染30 min,EHA105菌液浓度D=0.6,共培养5 d,经PCR法检测证明ACO反义基因已转入转化植株基因组中。