DREB基因双T-DNA植物表达载体的构建及验证

W 34基因经 pGEM T EASY载体 ,克隆到 pBDREB载体EcoRI位点 ,得到在Amp平板上生长的转化子 pBW 34-DREB质粒 ;质粒pBW 34-DREB、pSPROK、pBlueks分别经PstI/KpnI、KpnI/EcoRI、PstI/EcoRI双酶切 ,三片段连接构建成中间表达载体 pBWD Tnos;再用SmaI/EcoRV双酶切 pBWD Tnos,将回收的DREB基因的完整的表达结构元插入到经SmaI酶切的质粒载体 pCDMAR Hyg中 ,构建成双T DNA植物表达载体 pCDMAR pWDT Hyg ,大小为 13 5 9kb ,经酶切鉴定 ,证明构建的载体与预期设计的一致。将此双T载体用农杆菌介导法转化玉米胚性愈伤组织 ,期望得到无选择标记的安全的转基因植物。

At2基因双T-DNA植物表达载体的构建

以甜瓜品种‘MR-1’为试材,采用PCR技术,扩增出了At2基因并在两端添加BamHⅠ和SacⅠ酶切位点。结果表明:在NCBI上进行BLAST显示其氨基酸序列与GeneBank中已公布的At2基因的同源性为99%;经DNAMAN软件分析,核苷酸序列同源性为99.43%。将其连接在中间表达载体G-pPTN133上,得到替换了GUS基因的中间载体A-pPTN133。A-pPTN133再经ScaⅠ酶切后,插入到经ScaⅠ酶切的pPTN133^-中,构建成双T-DNA植物表达载体At2-pPTN133。经酶切和PCR鉴定证明了所构建载体的正确性。

番木瓜β-Gal基因RNAi双T-DNA植物表达载体的构建及其遗传转化的初步研究

克隆了番木瓜(Carica papaya L.)果肉的细胞壁水解关键酶β-半乳糖苷酶(β-GAL)基因保守区,将其反向重复插入载体pKANNIBAL,构建RNAi中间表达载体pKAN/RG,将其上的发夹结构取代经改造的载体pCAMBIA1300上hptⅡ基因,构建中间表达载体p1300-/MFRG,分离单T-DNA区段,与载体pCAMBIA2301构建RNAi双T-DNA植物表达载体p2301/TTRG。酶切分析和PCR检测表明,p2301/TTRG已被成功导入农杆菌EHA105。通过遗传转化,初步获得了GUS染色呈阳性且具Kan抗性的番木瓜胚性愈伤组织。

LFY基因双T-DNA植物表达载体的构建

LFY基因是从从野生型拟南芥中克隆出的一个与调控花分生组织启动相关的基因,它有促进植物提早开花的作用。用PCR方法从克隆载体上扩增出LFY基因并在两端添加XhoⅠ酶切位点,将其连接在用XhoⅠ切除了hyg基因的pCAMBIA1301表达载体上,得到去除选择标记的LFY基因植物表达载pCAM-BIA1301-LFY。质粒pCAMBIA1301经HindⅡ/EcoRⅠ双酶切补平自连后得到去除多克隆位点的质粒pCAMBIA1301-,再经SacII/SphI双酶切后插入到经SacⅡ酶切的pCAMBIA1301-LFY中。建成双T-DNA植物表达载体pCAMBIA1301-LFY-hyg-,经酶切鉴定证明了所构建载体的正确性。将此双T-DNA载体用农杆菌介导法转化菊花叶片,期望得到无选择标记含LFY基因的转基因菊花。

多基因双T-DNA植物表达载体的构建及拟南芥转化

多基因植物表达载体用于植物遗传转化是培育具有多种优良品质作物的有效策略.双T-DNA系统是实现筛选完成后选择标记基因删除的一种简便可行的方式.为培育高度抗逆或去除标记基因的农作物,构建了多基因双T-DNA植物表达载体2T-bbgdD,其中含有一个抗除草剂基因bar,3个抗逆相关基因(DREB1A,Na+依赖性Pi转运体基因(d5),betA)和一个报告基因gfp.利用农杆菌介导法将该载体转入拟南芥,获得了多基因共转化及去除标记基因的转基因拟南芥.可将此植物表达载体进一步用于作物的遗传转化.

双T-DNA反式串联植物表达载体构建与验证

通过对双T-DNA串联结构的改变,构建2个双T-DNA反式串联的植物表达载体p1300-DMAR-LF-GCMSAGS和p1300-DMAR-LF-GLCMSAGS。经过转化水稻后验证,结果表明:能够获得无选择标记基因的转基因植株;与顺式串联植物表达载体比较,反式串联的植物表达载体成功地将非连锁共整合的频率分别由47.37%和45.83%提高到了55.81%和51.28%,提高无选择标记基因转基因植株的筛选效率。

具双T-DNA区的大麦黄矮病毒复制酶基因RNAi植物表达载体的构建(英文)

RNAi系双链RNA诱导同源mRNA降解,导致特定基因表达沉默的一种现象.RNAi技术是通过基因工程防治植物病毒病的最佳途径.由大麦黄矮病毒(Barely yellow dwarf virus,简称BYDV)引起的禾谷类黄矮病发病面积和危害程度在我国呈加重趋势.BYDV-GAV是当前流行的大麦黄矮病毒株系,本文针对BYDV-GAV复制酶基因序列,构建能在细胞内转录形成发卡RNA双链结构的表达盒,并将其置于中间载体pVec8-2b的T-DNA区,pVec8-2b的另一T-DNA区含有hpt选择报告基因表达盒.具双T-DNA区的病毒复制酶基因发卡RNA高效表达载体已导入根癌农杆菌,可用于诱导植物RNAi,创制无选择标记基因的抗大麦黄矮病转基因作物.

CMO,BADH双基因植物表达载体的构建

以pC1303质粒和pC1391质粒为基础,利用载体pBIUC和pBIB构建了分别有Ubi启动子、35S启动子调控的带有控制甜菜碱合成的CMO和BADH的植物表达载体pC1303-Ubi-CMO-35S-BADH,为进一步开展提高植物抗逆性基因工程提供了基础。

番木瓜β-Gal基因的克隆分析与植物表达载体构建

番木瓜果实采后贮藏期间的迅速软化与β-Gal基因的表达密切相关。利用常规PCR结合反向PCR技术,分离了一条4501bp的番木瓜β-Gal基因组序列。其共含有17个内含子,外显子部分与相应的cDNA序列只有1个碱基的差异。生物信息学分析结果表明,该番木瓜β-GAL属于糖苷水解酶超级家族42中家族35的成员,在进化过程中与拟南芥的亲缘关系较近,与鳄梨和北美云杉则较远。同时,它还具有一段定位于胞外的信号肽,再次表明其可能参与了果肉细胞壁的降解和果实软化。进一步分离了β-Gal基因启动子,初步验证了其果实表达特异性。将该启动子替换载体p2301/TTRG上的CaMV 35S启动子,构建出RNAi-β-Gal双T-DNA植物表达载体。酶切分析和PCR检测结果表明,载体p2301/BPTTRG已被成功导入农杆菌,可用于后续的遗传转化研究。

黄连对羟基苯基丙酮酸双加氧酶基因的植物表达载体构建

目的:构建除草剂抗性基因黄连对羟基苯基丙酮酸双加氧酶的植物表达载体。方法:通过PCR从重组质粒pGWB2/Cjhppd中扩增出大小为1 300bp的目的片段,亚克隆到pGEM-T easy上。BamHⅠ和SpeⅠ双酶切pGEM-T Easy/Cjhppd和质粒pCambia1 301,回收得到1 300bp的Cjhppd基因片段和开环质粒pCambia-1301-UbiN,用T4连接酶连接,得到重组质粒,利用三亲法将其导入农杆菌EHA105中。结果:成功得到农杆菌EHA105的阳性菌落,菌落PCR扩增得到和预期大小一致的1300bpDNA片段。结论:成功将具有除草剂抗性的Cjhppd构建到了含有玉米泛素启动子Ubi和选择性标记基因Hpt的植物表达载体pCambia-1301-UbiN/Cjhppd,并导入根癌农杆菌EHA105中,可以用于水稻等单子叶植物的遗传转化。

基于phy基因的双边界植物表达载体构建

采用同源克隆方法从泡盛曲霉中克隆了1515bp的植酸酶基因,与黑曲霉(A.niger963)phyA2的核苷酸同源性为95%。以植物表达载体pTTBUG8为基础,构建了由35S启动子调控、具有磷高效利用功能基因(phy)的双边界植物表达载体pBSP。解决了bar基因及其产物PAT蛋白的安全性及产权等问题,并为植物养分高效利用基因工程研究奠定了重要基础。

甘草鲨烯合成酶基因的分离及植物表达载体的构建

采用RT-PCR技术从乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)中克隆甘草鲨烯合成酶(Squalene Syn-thase,SS)基因,并通过酶切连接的方法构建相关植物表达载体。结果表明,两个SS基因编码区长分别为1242bp、1239bp,分别编码412、413个氨基酸残基的多肽,与Hayashi等报道的光果甘草两个SS基因(GgSQS1和GgSQS2)同源性高达98%,分别命名为GuSQS1和GuSQS2(GenBank登录号分别为:AM182329,AM182330);植物表达载体构建的鉴定结果表明,已将GuSQS1和GuSQS2序列分别正向插入到双T-DNA表达载体中的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,重组质粒分别命名为130/35S-GuSQS1和130/35S-GuSQS2,为今后的次生代谢基因工程研究奠定基础。

eGfp/Gus融合基因植物表达载体的构建和转化验证

绿色荧光蛋白(Gfp)基因和葡萄糖醛酸糖苷酶(Gus)基因是广泛应用的2个报告基因,在定性和定量研究基因表达和启动子功能等方面各有优劣。为联合使用这2个报告基因,根据报告基因序列设计2对带有特异限制性内切酶位点的引物,PCR法分别扩增增强型Gfp(eGfp)和Gus基因,连接到植物表达载体pF-GC5941中,构建含CaMV35S启动子驱动的eGfp/Gus基因融合表达载体,命名为pFGC-DR。注射农杆菌法转化烟草叶片,以及花器官农杆菌浸泡法转化拟南芥,发现融合基因成功地在烟草叶片中瞬时表达和在拟南芥中稳定表达,表明融合报告基因在烟草和拟南芥中都能高效表达。

冷相关转录因子CBF2基因的克隆及其植物表达载体的构建

从拟南芥Columbia基因组DNA中分别克隆了CBF2基因和低温诱导型启动子Rd29A。测序结果显示:克隆的CBF2基因长725 bp,编码216个氨基酸,与GeneBank公布的的序列相比对,核苷酸同源性为99.8%;启动子Rd29A全长为956 bp,与已报道的该启动子序列比较,其核苷酸同源性为99.5%。以双元载体pCAMBIA1301为基础,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-CBF2,为利用CBF2基因提高植物的耐寒性创造了条件。

无选择标记的高光效基因植物表达载体的构建

构建无选择标记的玉米高光效基因植物表达载体,旨在利用共转化系统获得无标记基因的高光效转基因植物.

木薯MeGWD3基因克隆及植物表达载体构建

【目的】克隆木薯葡聚糖水合双激酶(Me GWD3)基因并构建其植物表达载体,为开展木薯Me GWD3基因调控及功能研究提供参考。【方法】采用RT-PCR从木薯华南124(SC124)中克隆Me GWD3基因,对其进行序列分析,并将其连接至改造的p CAMBIA2300载体,构建植物表达载体p CAMBIA2300-Me GWD3。【结果】Me GWD3基因全长3522 bp,编码1173个氨基酸。经序列比对,发现Me GWD3基因序列与木薯Phytozome数据库中公布的GWD基因(cassava4.1_000497m)只存在2个碱基差异,同源性高达99.94%;与NCBI数据库中收录的木薯GWD基因(JN618460)同源性高达99.00%,与蓖麻GWD基因(XM_002518566)同源性达86.00%;成功构建植物表达载体p CAMBIA2300-Me GWD3。【结论】成功构建的植物表达载体p CAMBIA2300可用于Me GWD3基因功能及木薯淀粉代谢研究。

抗冻肽基因在植物表达载体中的构建

植物表达载体 PBin4 3 8经 Hind 和 Eco P 双酶切 ,回收其 Hind — Bma H -Sal — Eco R 片段 ,和PUC19Hind —ECORI片段连接 ,构建成载体记为 PUC3 8。将含 AFP基因的克隆经 Bam HI、Xho I双酶切 ,得到的Bam HI— AFP— Xho I片段装入 PUC3 8Bam HI— Sal I位点 ,克隆 AFP基因。然后再用 Hind 、EORI双酶切 AFP基因 ,插入 PBin4 3 8的 Hind — Eco R 位点 ,进而构建成带有 AFP基因的植物表达载体 ,为进一步研究

用于中草药基因工程的双价双-T表达载体的构建

以紫外线和水杨酸诱导后的烟草为材料,对经过修饰的烟草I类几丁质酶和I类β-1,3-葡聚糖酶cDNA进行了克隆和序列分析,然后分别加上Hsr203J启动子和NOS终止子,依次插入到同一个双T植物表达载体130上,获得植物双价双T表达载体。经酶切和PCR鉴定证明构建的载体与预期设计的一致。