利用双T-DNA载体系统培育无选择标记转基因烟草(英文)

建立了一种利用双T-DNA载体培育无选择标记转基因植物的方法.通过体外重组构建了双T-DNA双元载体pDLBRBbarm.载体中,选择标记nptⅡ基因和另一代表外源基因的bar基因分别位于2个独立的T-DNA.利用农杆菌介导转化烟草(Nicotiana tabacum L.),在获得的转化植株中,同时整合有nptⅡ基因和bar基因的频率为59.2%.对4个同时整合有nptⅡ和bar基因植株自交获得的T1代株系进行检测分析,发现在3个T1代株系2个T-DNA可以发生分离,其中约19.5%的转基因T1代植株中只存在bar基因而不带选择标记nptⅡ.这一结果说明双T-DNA载体系统能有效地用于培育无选择标记的转基因植物.研究还利用位于2个不同载体上的nptⅡ基因与 bar基因通过农杆菌介导共转化烟草,获得共转化植株的频率为20.0%～47.4%,低于使用双T-DNA转化的共转化频率.

具双T-DNA区的大麦黄矮病毒复制酶基因RNAi植物表达载体的构建(英文)

RNAi系双链RNA诱导同源mRNA降解,导致特定基因表达沉默的一种现象.RNAi技术是通过基因工程防治植物病毒病的最佳途径.由大麦黄矮病毒(Barely yellow dwarf virus,简称BYDV)引起的禾谷类黄矮病发病面积和危害程度在我国呈加重趋势.BYDV-GAV是当前流行的大麦黄矮病毒株系,本文针对BYDV-GAV复制酶基因序列,构建能在细胞内转录形成发卡RNA双链结构的表达盒,并将其置于中间载体pVec8-2b的T-DNA区,pVec8-2b的另一T-DNA区含有hpt选择报告基因表达盒.具双T-DNA区的病毒复制酶基因发卡RNA高效表达载体已导入根癌农杆菌,可用于诱导植物RNAi,创制无选择标记基因的抗大麦黄矮病转基因作物.

甘草鲨烯合成酶基因的分离及植物表达载体的构建

采用RT-PCR技术从乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)中克隆甘草鲨烯合成酶(Squalene Syn-thase,SS)基因,并通过酶切连接的方法构建相关植物表达载体。结果表明,两个SS基因编码区长分别为1242bp、1239bp,分别编码412、413个氨基酸残基的多肽,与Hayashi等报道的光果甘草两个SS基因(GgSQS1和GgSQS2)同源性高达98%,分别命名为GuSQS1和GuSQS2(GenBank登录号分别为:AM182329,AM182330);植物表达载体构建的鉴定结果表明,已将GuSQS1和GuSQS2序列分别正向插入到双T-DNA表达载体中的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,重组质粒分别命名为130/35S-GuSQS1和130/35S-GuSQS2,为今后的次生代谢基因工程研究奠定基础。

番木瓜β-Gal基因的克隆分析与植物表达载体构建

番木瓜果实采后贮藏期间的迅速软化与β-Gal基因的表达密切相关。利用常规PCR结合反向PCR技术,分离了一条4501bp的番木瓜β-Gal基因组序列。其共含有17个内含子,外显子部分与相应的cDNA序列只有1个碱基的差异。生物信息学分析结果表明,该番木瓜β-GAL属于糖苷水解酶超级家族42中家族35的成员,在进化过程中与拟南芥的亲缘关系较近,与鳄梨和北美云杉则较远。同时,它还具有一段定位于胞外的信号肽,再次表明其可能参与了果肉细胞壁的降解和果实软化。进一步分离了β-Gal基因启动子,初步验证了其果实表达特异性。将该启动子替换载体p2301/TTRG上的CaMV 35S启动子,构建出RNAi-β-Gal双T-DNA植物表达载体。酶切分析和PCR检测结果表明,载体p2301/BPTTRG已被成功导入农杆菌,可用于后续的遗传转化研究。

无选择标记转中国对虾抗菌肽基因水稻的获得及其遗传分析、抗病检测

为了获得不含筛选标记、抗病性显著增强的转抗菌肽基因水稻,利用双T-DNA载体系统将中国对虾抗菌肽基因dp3和选择标记基因Hpt导入到水稻恢复系明恢86中。结果表明,T1代110个株系中88.2%的株系出现抗感分离,其余11.8%的株系全为阴性。PCR检测7个分离比例符合3∶1的株系显示,dp3和Hpt基因在3个株系中为自由组合,在4个株系中出现连锁。在468个检测单株中筛选出31个无选择标记的转基因植株,占总样本的6.6%。RT-PCR检测T1代转基因植株显示,抗菌肽基因在RNA水平上得到表达。用白叶枯病小种PXO86、PXO99和纹枯病小种GD-118、C-30对上述3个转基因株系进行接种,转基因阳性植株明显提高了对白叶枯病和纹枯病的抵抗力。

真菌免疫调节蛋白基因LZ-8过表达载体的构建及转化灵芝原生质体的研究

灵芝Ganoderma lingzhi是我国著名的药用真菌。但是,作为一种营养和保健价值都非常高的大型担子菌,灵芝还缺乏完善的转基因方法和安全转基因体系。本研究建立了免疫调节蛋白基因的过表达系统,并利用真菌特异性启动子GPD、终止子NOS和目的基因LZ-8构建真菌特异性双T-DNA表达载体p SB130NG-LZ8;利用溶壁酶提取灵芝原生质体,并用FDA染色法检测灵芝原生质体活性,原生质体成活率约为80%。通过PEG转化法对灵芝原生质体成功进行了转化,转化得到的原生质体在带有潮霉素抗性平板上长出,转化率为3–4/μgpSB130NG-LZ8+107个原生质体。转化子通过PCR检测和荧光定量PCR检测,获得LZ-8在灵芝中的过表达。

疱疮丙酸杆菌亚油酸异构酶基因转化亚麻芥

亚油酸异构酶可特异性地催化亚油酸转化为活性共轭亚油酸异构体。本研究采用PCR技术从疱疮丙酸杆菌GIM1.243中扩增出亚油酸异构酶基因PAI,片段长1275bp。按照目标宿主亚麻芥的密码子偏好性对该基因部分序列进行优化,命名为CaPAI。借助双T-DNA表达载体pSB130,用菜豆种子特异性启动子PhaP替换原有的CaMV35S启动子,驱动CaPAI,终止子替换成菜豆的终止子PhaT;另一个T-DNA保留其原有的表达框,其中含有潮霉素筛选标记基因。通过农杆菌介导的FloraDip转化法,将构建好的高效植物表达载体pSB130-PhaP-CaPAI-PhaT转入亚麻芥中,抗性筛选和PCR鉴定显示CaPAI基因已整合进亚麻芥基因组中。