砂梨ACC合酶cDNA全长克隆及其反义与正义表达载体构建

为构建干扰砂梨(Pyrus pyrifolia Nakai)ACC合酶基因表达的遗传转化载体,利用RACE技术从'早生新水'成熟果实cDNA中克隆了ACC合酶的cDNA,该cDNA全长为1939bp,命名为Pyp-ACS,GenBank登录号为EF566865。Pyp-ACS核苷酸序列含有5′末端非翻译区109bp、1488bp完整的开放阅读框和3′末端非翻译区342bp(含25bp的Ploy+(A))。Pyp-ACS编码495个氨基酸,与白梨(Pyrus×bretschneideri Rehd.)、西洋梨(Pyrus communisL.)、中国李(Prunus salicina Lindl.)、桃(Prunus persica(L.)Batsch)、梅(Prunus mume Seib.et Zucc.)、苹果(Malus×domestica Borkh.)和柿(Diospyros kaki Thunb.)有较高的同源性。该氨基酸序列具备ACC合酶7个保守区和组成该酶活性中心的12个氨基酸残基,即SLSKDMGFPGLR,进一步验证了克隆的正确性。以pYPX145载体为基础,分别将Pyp-ACS编码区序列反向和正向插入相应位点构建反义和正义表达载体,并分别命名为pPyp-ACS(-)和pPyp-ACS(+),目的基因由双35S启动子所控制。分别将这2个表达载体导入根癌农杆菌菌株(Agrobacterium tumefaciens)EHA105,为耐贮藏转基因梨的遗传转化提供载体。