Ki67反义肽核酸、反义寡核酸对肾癌细胞系增殖及凋亡影响的研究

目的探讨肿瘤增殖相关基因Ki67反义肽核酸(PNAs)、反义寡核酸(ASODNs)对人肾癌细胞增殖及凋亡的调控。寻找肾癌反义治疗的合适药物。方法将PNAs转染人肾癌786-0细胞系,采用免疫组化、Westernblot技术检测Ki67表达,细胞生长曲线、3H-thymidine掺入试验检测肾癌细胞增殖,TUNEL法检测癌细胞凋亡。并与相同浓度的ASODNs进行对比。结果PNAs处理组(10μmol/L)786-0细胞Ki67表达阳性率(%)(16.9±0.7)降低,Ki67蛋白(%)(42.1±2.2)降低,与ASODNs处理组(28.6±0.4)(83.6±1.4)比较差异有显著性(P<0.01,P<0.01)。PNAs处理组3H-thymidine掺入率(%)(20.7±1.5)减少,与ASODNs处理组(58.6±1.4)比较差异有显著性(P<0.01)。PNAs处理组凋亡细胞阳性率(%)(28.7±2.3)增加,与ASODNs处理组(13.8±1.0)比较差异有显著性(P<0.01)。结论PNAs可在反义及反基因二个环节发挥抗肿瘤作用,与ASODNs相比,PNAs有更强的阻抑人肾癌Ki67基因表达、增殖及促进凋亡作用,是一种有前途的基因治疗药物。

HIF-1α反义寡核苷酸脂质体的制备和对视网膜血管内皮细胞HIF-1α表达的影响(英文)

目的应用HIF-1αASODN处理牛眼视网膜微血管内皮细胞,观察细胞摄取ASODN的情况和对缺氧时细胞HIF-1α表达的影响。方法对分离的牛视网膜血管内皮细胞进行HIF-1α反义寡核苷酸的转染,CoCl2模拟缺氧培养,采用免疫组化检测不同缺氧时间HIF-1α的表达。结果硫代化修饰的标有FAM的HIF-1α反义寡核苷酸能被Lipofectin转染进BREC细胞。转染6h后,在荧光显微镜下可观察到细胞内的绿色荧光斑。计算细胞转染率为(93.8±3.4)%。未转染组开始时HIF-1α有极低表达,在缺氧1h时表达量显著上升,4h达到高峰,16h后下降。而ASODN转染组HIF-1α的表达始终在极低水平,两组间有显著性差异(P<0.01)。结论以脂质体为载体能高效率地将HIF-1αASODN转染至视网膜血管内皮细胞内,明显抑制HIF-1α蛋白质的表达,这可能为HIF-1αASODN用于视网膜新生血管的治疗提供理论依据。

bcl-2反义寡核苷酸增强K562白血病细胞对As_2O_3药物敏感性

采用细胞培养法 ,免疫组化实验技术和流式细胞仪等项技术 ,研究了bcl 2基因反义核酸和砷剂单独及联合应用对K5 6 2细胞的生物效应 ,DNA及bcl 2蛋白的变化。结果显示 ,As2 O3(2 .0 μmol L) +bcl 2ASODN(10 .0 μmol L)联合作用比单用As2 O3 (2 .0 μmol L)或bcl 2ASODN(10 .0 μmol L)显著增强诱导细胞凋亡的作用 (P <0 .0 1) ;流式细胞仪检测显示 ,联合作用引起的bcl 2蛋白表达亦明显减少 (P <0 .1)。结论表明 ,bcl 2基因反义核酸能明显提高和显著增强K5 6 2白血病细胞对As2 O3

hTERT反义寡核苷酸对子宫内膜癌细胞增殖的影响

目的探讨人端粒酶催化亚基(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)反义寡核苷酸对子宫内膜癌细胞增殖的影响。方法反义寡核苷酸转染ishikawa细胞系,采用TRAP-ELISA法检测转染后细胞端粒酶的活性,观察其前后的变化。MTT法检测细胞活性,流式细胞仪观察细胞周期及细胞凋亡率变化。结果转染细胞的端粒酶活性及细胞生长都明显受到抑制。流式细胞仪检测到细胞凋亡峰,细胞阻滞于使细胞停滞在G_0～G_1期,并诱导细胞凋亡,正义寡核苷酸则无此作用。结论端粒酶hTERT为靶点的反义寡核苷酸可明显抑制子宫内膜癌细胞的增殖,且具有促凋亡作用。

miR-30d在舌鳞状细胞癌组织中表达及反义miR-30d对细胞增殖、侵袭能力的影响

目的:探讨miR-30d在舌鳞状细胞癌组织中表达及反义miR-30d对细胞增殖、侵袭能力的影响。方法:选取2013年3月~2015年4月在我院行根治性手术治疗的TSCC患者68例,实时荧光定量PCR检测TSCC组织和癌旁正常组织中miR-30d基因表达,培养舌癌SCC-4细胞,分为ASO-miR-30d组、ASO-阴性对照组和空白对照组,检测各组细胞中miR-30d基因表达,MTT法检测各组细胞增殖能力,Transwell法检测各组细胞迁移和侵袭能力。结果:TSCC组织中miR-30d相对表达量(1.89±0.21),显著高于癌旁正常组织的(1.31±0.16),差异有统计学意义(P=0.000);TSCC组织中miR-30d相对表达量与TNM分期、分化程度和颈淋巴结转移有关(P<0.05);与空白对照组和ASO-阴性对照组比较,ASO-miR-30d组细胞中miR-30d相对表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05);MTT实验结果显示,与空白对照组和ASO-阴性对照组比较,ASO-miR-30d组24h、48h、72h和96h时细胞A值均降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与空白对照组和ASO-阴性对照组比较,ASO-miR-30d组迁移细胞数和侵袭细胞数均减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-30d在TSCC组织中呈高表达,反义miR-30d可有效减少TSCC细胞增殖,抑制细胞迁移和侵袭能力。

反义miR-18a对乳腺癌细胞侵袭迁移的影响

目的:分析miR-18a在乳腺癌组织中的表达情况;体外研究miR-18a反义寡核酸(antisense oligonucleotide,ASO)对乳腺癌细胞侵袭和迁移的影响。方法:运用荧光定量PCR检测108例乳腺癌组织及对应癌旁乳腺组织中miR-18a的表达;通过miR-18a ASO降低乳腺癌细胞中miR-18a的表达,采用Transwell实验和划痕实验观察miR-18a ASO对乳腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响,同时运用Western blot的方法检测侵袭相关蛋白的表达变化。结果:在108例乳腺癌病例中,50.93%(55/108)的乳腺癌组织miR-18a表达明显高于对应正常组织(t=28.68,P=0.000);与空白对照组和转染随机ASO组相比,miR-18a ASO可以明显降低miR-18a的表达(F=321.67,P=0.001;F=563.28,P=0.000);Transwell实验和划痕实验结果显示转染miR-18a ASO后,乳腺癌细胞的侵袭迁移能力明显下降(P=0.000),同时相关侵袭蛋白基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2和MMP9表达下降(P=0.000)。结论:miR-18a在乳腺癌组织中表达上调,降低miR-18a的表达,可有效抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移。miR-18a有可能成为乳腺癌侵袭转移调控的新靶点。

反义抑制miRNA-155对皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖、凋亡及侵袭力的影响

目的观察转染反义微小核糖核酸(miRNA)-155对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭力的影响。方法采用脂质体介导对皮肤鳞状细胞癌A431细胞转染miRNA-155无义序列(阴性对照组)、转染反义miRNA-155(转染组),空白对照组细胞不作处理。实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测转染后A431细胞miRNA-155的相对表达水平;采用四甲基偶氨唑盐(MTT)检测转染后皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖活性;采用流式细胞术(FCM)检测转染后皮肤鳞状细胞癌A431细胞周期改变和凋亡变化;采用Transwell法检测侵袭力与细胞迁移能力。结果转染组A431细胞中miRNA-155 mRNA的相对表达水平低于空白对照组和阴性对照组(F=634.57,P<0.01),但空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义。转染72 h后,转染组较空白对照组和阴性对照组细胞存活率明显降低,转染120 h降低最为明显(P<0.05)。转染组G_0/G_1期细胞增多,S期细胞减少,整体细胞增殖指数降低,A431细胞凋亡率、细胞迁移和侵袭力升高(P<0.05),但各组G_2/M期细胞周期变化、后2组A431细胞凋亡率、细胞迁移和侵袭力差异无统计学意义。结论皮肤鳞状细胞癌A431细胞转染反义miRNA-155可减少miRNA-155的表达,有效抑制A431细胞增殖,促进其凋亡。miRNA-155可能成为治疗皮肤鳞状细胞癌基因表达调控的新靶点。

针对HBV调节基因ENⅡ的ASON抑制HBV复制表达的体外研究

目的 :筛选出高效特异而无毒的抗HBV反义寡核苷酸片段。方法 :以 2 2 15细胞为模型 ,设计合成针对HBVENⅡ的反义硫代寡苷酸 (ASON) ,ELISA法检测ASON对宿主细胞分泌表达HBsAg和HBeAg的抑制作用 ,MTT法检测ASON对细胞增殖代谢的影响。结果 :ASON对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为 92 %和 75 % ,与非互补序列对照组 (抑制率均为 11% )相比差异有显著性意义 (P <0 0 0 1) ,用药前后MTT比色结果和活细胞比率差异无显著性意义 (P >0 0 5 )。结论

基因沉默策略及其应用研究进展

基因沉默(Gene silencing)是生物体中特定基因由于各种原因不表达或表达减少的现象,是通过表观遗传控制基因表达的重要机制,通过基因沉默技术探索疑难疾病的治疗方法是当下的研究热点.随着基因工程的迅速发展,基因沉默技术不断有新技术出现取代已有的技术.对基因沉默技术所包括的核酶技术、反义寡核酸技术、基因敲除、RNA干扰技术及其应用进行介绍.

内源性TGF-β_1、TNF-α在三氧化二砷诱导HL-60细胞凋亡中作用的研究

目的 探讨内源性TGF β1、TNF α在三氧化二砷 (As2 O3)诱导HL 6 0细胞凋亡过程中的作用。方法 建立As2 O3 诱导HL 6 0细胞凋亡模型 ,应用RT PCR、定量PCR、ELISA、缺口末端标记(TUNEL)法、片段化DNA分析等方法研究As2 O3 诱导HL 6 0细胞凋亡过程中内源性TGF β1、TNF α及其受体基因以及TGF β1蛋白表达的变化 ;进而研究TGF β1、TNF α反义磷酸硫代脱氧寡核苷酸 (PSODN)对细胞凋亡的干预作用。结果 ①As2 O3 诱导HL 6 0细胞凋亡过程中伴有TGF β1、TNF α表达上调 (处理前后mRNA拷贝数分别为 135 46± 12 4,4972 16± 187和 2 32 73± 2 2 9,6 742 17± 189) ,bcl 2表达下调 (处理前、后分别为 10 42 4± 2 74和 336 1± 89) ,细胞培养 2 4h上清中TGF β1蛋白水平明显提高 ,上升为对照组的 2 .0倍。②TGF β1、TNF α反义PSODN能够明显抑制As2 O3 诱导细胞凋亡的发生 ,并使细胞bcl 2mRNA及蛋白表达恢复到处理前的水平。结论 内源性TGF β1、TNF α在As2 O3 诱导HL 6 0细胞凋亡中起重要作用 ,两者均可通过下调bcl 2表达促进细胞凋亡。