c-fos基因的反义寡聚脱氧核苷酸鞘内注入减弱福尔马林引起的大鼠伤害性行为反应及脊髓背角Fos蛋白和强啡肽 A表达的研究(英文)

本研究通过鞘内注射 c-fos反义寡聚脱氧核苷酸 (antisense oligodeoxynucleotide,AS-ODN)封闭背角中 F os蛋白的表达 ,观察了 Fos蛋白合成和慢痛反应的关系 ,并分析 Fos蛋白合成和强啡肽 A(Dyn A)表达之间的关系。实验组动物 (n=5 )鞘内预先注射 c-fos的 AS-ODN(5 0μg,5μl) ,另两个对照组 (每组 n=5 )分别注射等量生理盐水和 AS-ODN的反序核苷酸 (reverseoligodeoxynucleotides,RS-ODN,5 0μg,5μl) ;4h后 ,各组动物均在一侧后肢脚掌皮下注射 formalin(5 % ,5 0μl) ,并立即用计算动物舔拭注射侧后脚掌累计时间的方法 ,检测大鼠的伤害性行为反应 ,行为检测后 1h处死动物 ,用免疫组化方法检查脊髓背角中 Fos蛋白阳性神经元的数量和强啡肽 A(1～ 8)的表达量。结果发现 ,和两个对照组相比 ,实验组动物 Formalin诱发的伤害性行为反应的第二相明显减弱 ,同时 Form alin注射侧背角 F os蛋白样免疫阳性细胞的数量和 Dyn A含量的灰度值明显减少。本研究结果提示 ,外周伤害性刺激引起的长期持续的痛反应是以 c-fos基因表达增加及受其调控的 Dyn A表达上调为基础的 ,由此推测在脊髓背角神经元中 Fos蛋白和 Dyn

制备脂质体包裹的^(99m)锝标记c-myc mRNA反义寡聚核苷酸的研究

探讨脂质体包裹的 99m-锝标记 c- myc m RNA反义寡聚核苷酸的制备方法 ,为反义显像和反义治疗的实验研究奠定基础。合成 15 bp的反义寡聚核苷酸 (DNA)和双功能螯合剂 -联肼尼克酰胺衍生物 ,DNA与双功能螯合剂偶联后 ,用 99m锝标记 ,然后用 C1 8Sep- Pak反相柱进行纯化 ,根据纯化结果 ,绘制淋洗曲线 ,计算标记率。再用阳离子脂质体对纯化产物进行包裹 ,获得脂质体包裹的 99m锝 - DNA。用纸层析测定脂质体包裹的 99m锝 - DNA的放射性化学纯度及与水、血清孵育后的稳定性。结果 ,不同放射性活度的 99m Tc O4 - 标记时的标记率为 :14 80 MBq时为 6 3.37%± 3.5 1% ,74 0 MBq时为 6 2 .5 2 %± 3.6 9% ,5 92 MBq时为 5 9.82 %± 5 .12 % ,经 χ2检验无显著性差异。脂质体包裹 99m Tc- DNA的放射化学纯度 =96 .4 7%± 3.0 1% ,与水、血清孵育后脱落的 99m Tc极少 ,可见 99m Tc- DNA的稳定性极好。由此可见 ,以脂质体作载体 ,联肼尼克酰胺衍生物作为双功能螯合剂 ,可制备脂质体包裹的

比较和分析NtGNL1的反义寡聚核苷酸抑制在烟草三种培养体系中的效果

为探讨反义寡聚核苷酸抑制(antisense oligodeoxynucleotides inhibition)技术在植物材料上的应用,以已知功能的NtGNL1(Nicotiana tabacum GNOM-Like1)为目标基因,寻找反义寡聚核苷酸抑制最适作用体系,并进一步分析NtGNL1的具体作用。根据目标基因mRNA序列设计反义寡聚核苷酸序列,商业合成后并将其添加到烟草胚珠、种子和花粉管离体培养的培养基中,以抑制NtGNL1的表达。结果表明,将反义寡聚核苷酸引入离体培养系统,短时间内抑制了目标基因mRNA的表达,但对胚胎发育过程的影响和种子萌发的抑制都不明显。在花粉离体萌发系统中,反义寡聚核苷酸抑制能够高效地引起目标基因mRNA的下调。对FM4-64染色的花粉管显微缩时观察发现,NtGNL1的下调能够引起囊泡分布和运输方向的改变。对花粉管膜流相关的5个基因的半定量分析也显示反义寡聚核苷酸进入花粉管后,导致3个基因的表达下调,暗示NtGNL1抑制表达会影响花粉管囊泡运输的多个节点。

c-fos反义寡聚核苷酸对亚硒酸钠引起的皮质神经元凋亡的保护作用(英文)

本文利用 c-fos ASO(反义链全部硫代磷酸化修饰 )技术阻断 c-fos的表达 ,观察此项处理对亚硒酸钠在体外培养皮质神经细胞致凋亡作用和相关基因表达改变的影响。结果显示 :( 1) c-fos ASO可阻断亚硒酸钠的致凋亡作用 ,且有一定的剂量和时间依赖性 ;用琼脂糖凝胶电泳分析由各个时间点提取的 DNA片段 ,与对照组比较 ,c-fos ASO能明显阻断亚硒酸钠诱导的典型的 DNA梯型 ;用流式细胞仪检测得到的 DNA含量直方图也显示 ,在 c-fos ASO处理后 ,与对照组比较 ,亚硒酸钠引起的亚二倍体峰变小 ;( 2 )用 RT-PCR法检测表明 ,在用 c-fos ASO和亚硒酸钠处理皮质神经细胞后 ,不仅阻断了 c-fos表达的上调 ,对其它几种基因表达的改变也有不同的影响 ,与对照组比较 ,c-fosm RNA在各个时间点 ( 0 .5、1、2、4和 2 4h)不再上升 ,bcl-2 m RNA则不再下降 ,bax m RNA和 ACh E m RNA都不再上升 ;唯一不同的是 ,p5 3m RNA的变化趋势则与未经 c-fos ASO预处理时基本相同 ,在多数时间点两组 p-5 3m RNA水平之间无显著性差异 ( P>0 .0 5 ) ,说明此基因的表达基本不受 c-fos ASO作用的影响。上述结果提示 ,亚硒酸钠诱导的神经元凋亡可能是一组级联式基因表达更变的结果 ,c-fos是其中的一个组成成员 ,它的表达改变被阻断后 ,处于它下游?

大鼠鞘内注入前强啡肽原的反义寡聚核苷酸减弱福尔马林引起的脊髓背角中强啡肽 A的合成和行为痛反应 :细胞免疫化学和行为学联合观察(英文)

应用大鼠鞘内预先注入对抗前强啡肽原表达的反义寡聚核苷酸技术 ,观察了此处理对动物后脚掌注射福尔马林 ( 5 %,1 0 0μl)诱发的行为痛反应的影响 ,同时在行为检查的 1 h后立即用免疫组化技术检测了大鼠腰髓背角 c-Fos蛋白和强啡肽 A( 1 -8)的表达。结果显示 ,上述反义寡聚核苷酸预处理可明显减弱注射福尔马林引起的行为痛反应 ,而且背角中强啡肽 A( 1 -8)表达下降 ,福尔马林引起背角 Fos蛋白合成不受影响。前已证明 ,鞘内注射对抗 c-fos的反义寡聚核苷酸 ,可以减弱福尔马林引起的痛反应 ,同时背角 Fos蛋白和强啡肽 A( 1 -8)表达量减小 ;因而本实验的结果表明 :( 1 )伤害性刺激诱导背角 Fos蛋白和强啡肽合成参与伤害性信息在脊髓的传递过程 ,Fos蛋白的合成先于强啡肽的合成。 ( 2 )在脊髓痛过敏状态的调制中 ,强啡肽是作为一种致痛因子而不是抗痛因子起作用。

鞘内注射TLR3反义寡聚核苷酸对脊神经结扎大鼠的镇痛作用

目的：探讨脊髓星形胶质细胞TLR3在神经病理性疼痛中的作用。方法：雄性SD大鼠,体重180~250 g。实验一：72只鞘内置管大鼠随机分为：生理盐水（NS）20μl＋脊神经结扎（SNL）（A组）,错义寡聚核苷酸（MM-ODN）20μg/d＋SNL（B组）,反义寡聚核苷酸（AS-ODN）20μg/d＋SNL（C组）。实验二：72只SNL后7天大鼠随机分为：SNL＋NS20μl（D组）,SNL＋MM-ODN20μg/d（E组）,SNL＋AS-ODN20μg/d（F组）。实验一和实验二分别于SNL前1天和后7天开始鞘注,每天一次,共7天;于术后-1、1、3、5、7、10、14天和-1、7、10、12、14天行行为学实验。实验一和实验二分别于术后7天和14天每组各随机取6只大鼠利用免疫组织化学法观察脊髓背角GFAP的表达,并于术后-1、3、7、14天和术后7、10、14天每组各随机取6只大鼠断头处死,取L4~5脊髓节段采用RT-PCR法测定TLR3和IL-6 mRNA的表达。结果：实验一：与A组比较,C组PWPT升高并持续至术后14天（P〈0.05）,C组各时间点PWL无明显变化（P〉0.05）;与A组和B组比较,C组脊髓背角GFAP免疫反应阳性产物表达相对面积分别下降46.4%（P〈0.01）和45.7%（P〈0.01）;与A组和B组比较,C组鞘内注射AS-ODN抑制了TLR3受体和IL-6 mRNA的表达。实验二D组、E组和F组在PWPT、PWL、GFAP表达和TLR3及IL-6 mRNA表达方面的差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：脊髓背角星形胶质细胞TLR3可能参与了神经病理性疼痛的发生与发展。

c-fos反义寡聚核苷酸对脑缺血性损伤和电针抗损伤作用的影响

用c fos反义寡聚核苷酸脑内微量注射、TTC染色、c Fos免疫组织化学和电针等技术和方法 ,探讨即早反应基因c fos在大鼠局灶性脑缺血 (MCAO)模型的脑损伤中和电针抗局灶性脑缺血脑损伤中所起的作用。实验结果表明 ,局灶性脑缺血可引起c fos在缺血侧皮质的大量表达 ,电针能部分抑制这种表达 ,使脑缺血梗死灶体积减小。在缺血中心区注射c fos反义寡聚核苷酸后 ,脑内c fos的表达基本上被完全阻断 ,导致脑梗死灶的体积明显增大 ,电针抗脑缺血脑损伤的作用也被取消。提示脑缺血后 ,脑内的c fos适度表达可能对脑损伤有一定的保护作用 ;电针可能部分抑制了脑内c fos表达 ,调整了缺血后的c fos表达的程度 ,对脑缺血损伤起一定的保护作用。

Survivin反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞生长的抑制

目的：观察survivin反义寡聚脱氧核苷酸（antisense oligodeoxynueleotide，ASODN）对人胃癌细胞株SGC-7901的抑制作用。方法：用ASODN与人胃癌细胞SGC-7901共同温育一定时间后，PCR检测ASODN处理后肿瘤细胞survivin mRNA的表达，倒置显微镜、电镜观察细胞生长形态变化，DNA电泳检测细胞DNA片段化分布，流式细胞术检测ASODN作用后人胃癌细胞SGC-7901的凋亡，TRAP法测定细胞端粒酶活性，MTT法检测ASODN对胃癌细胞增殖的抑制；上述实验以胃癌细胞不加ASODN和加无关寡聚脱氧核苷酸为对照。结果：ASODN作用后，肿瘤细胞survivin mRNA的表达受到明显抑制。survivin ASODN能诱导人胃癌细胞凋亡，在形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成；电泳呈凋亡特征性ladder条带；流式细胞术分析显示，在G1期前出现亚2倍体凋亡峰，肿瘤细胞凋亡率显著增高[（7．01±0、21）％ vs （25．00±0．52）％，P〈0．01]。ASODN作用后SGC-7901细胞端粒酶活性明显受到抑制（P〈0．01）。ASODN作用能明显抑制胃癌细胞的增殖，而且随ASODN浓度的增加（2×10^-5－5×10^-5mol／L）和作用时间延长（24－96h）而加强（P〈0．05或P〈0．01）。结论：survivin反义寡聚脱氧核苷酸能诱导胃癌细胞凋亡，从而抑制胃癌细胞的增殖。

c-Ha-ras和c-myc反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞生长增殖的影响

作者观察了人工合成的反义c-Ha-ras和 c-myc寡聚脱氧核昔酸(ASO-r,ASO-m)对两株胃癌细胞中Ha-ras癌基因表达和细胞生长增殖的影响。观察到ASO-r能显著抑制MGc-803细胞P21蛋白合成(作用12 h抑制率达48.10％,P<0.01),同时对其DNA合成和细胞增殖也有较显著的抑制作用(抑制率分别为76.79％,55.61％,P<0.05)。ASO-r对SGc-7901细胞的DNA合成和细胞增殖也有类似的抑制作用(抑制率分别为76.78％,62.02％,P<0.05)。ASO-m对两株细胞的细胞增殖和SGc-7901细胞DNA合成均无明显影响,仅对MGc-803细胞的DNA合成有抑制作用(抑制率为71.37％,P<0.05)。结果表明:ASO-r能够阻断c-Ha-ras癌基因表达,并抑制胃癌细胞生长增殖;c-Ha-ras癌基因可能是维持胃癌细胞恶性生长表型的主要因素。

端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人肝癌细胞的作用

目的 观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人肝癌细胞株的作用。方法 用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与人肝癌细胞株共同温育一定时间后 ,观察细胞形态变化 ,检测细胞DNA含量的分布 ,测定端粒酶活性。结果 端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导人肝癌细胞凋亡 ,抑制端粒酶活性 ,在形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成 ;电泳呈凋亡特征性Ladder带 ;流式细胞仪分析显示 ,在G1 期前出现亚二倍体凋亡峰 ;端粒酶活性抑制。结论 端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导肝癌细胞凋亡 ,抑制端粒酶活性 ,抑制端粒合成 。

氧化铁磁性纳米颗粒作为MDR1反义寡聚核苷酸载体的构建

目的：构建磁性纳米MDR1反义探针，评价以氧化铁磁性纳米颗粒作为载体转染MDR1反义基因的可行性。方法：应用多聚赖氨酸修饰葡聚糖包裹氧化铁纳米颗粒（dextrancoatedironoxidenanopartieles），并将此复合物与肿瘤多药耐药反义基因结合。采用琼脂糖凝胶电泳分析氧化铁磁性纳米颗粒结合MDR1反义基因的能力，结合氧化铁纳米颗粒作为载体进行荧光标记的反义寡聚脱氧核苷酸（asODN）体外细胞转染实验。结果：琼脂糖凝胶电泳显示纳米氧化铁在不同的pH值及各种质量比均有良好的DNA结合能力。纳米氧化铁可作为基因载体将MDR1反义基因转染细胞，荧光显微镜可观察到发绿色荧光的细胞，普鲁士蓝铁染色观察到细胞内的蓝色铁颗粒。结论：成功构建了MDR1反义基因磁性纳米颗粒。纳米氧化铁可作为基因载体转染人细胞。

保护薇乔缝线携载反义寡聚核苷酸的实验研究

目的：探讨手术缝线携载反义基因片断的可能性及可行性，为术中血管吻合口局部转染反义基因提供新的途径。方法：保护薇乔缝线反复浸于反义核酸溶液中７２ ｈ，溴化乙锭（ＥＢ）标记，紫外灯下观察其吸附反义基因的情况。将吸附反义基因的缝线置于生理盐水中分别于不同时间点测其释放的Ｄ值，绘出体外控释曲线。同时取释放液进行电泳分析。以在荧光标记的核酸溶液中浸过的缝线直接行兔颈总动脉吻合，２４ ｈ 取材制片荧光显微镜下观察。结果：吸附核酸的保护薇乔缝线经ＥＢ标记后在紫外灯下呈烧红的铁丝样，释放曲线提示２ ｈ 释放明显增加，３６ｈ 释放达高峰。电泳则可见随时间延长而逐渐变亮的电泳带。荧光显微镜下见吻合口附近血管壁全层散在荧光分布。结论：保护薇乔缝线可较大量携载反义基因片段，可于术中血管吻合时直接将反义基因转移至吻合口并缓慢释放。

bcl-2反义寡聚脱氧核苷酸抑制HL-60细胞生长的研究

在体外培养中研究了基因的反义寡聚脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleo-tide,ASON)对HL-60细胞生长增殖的影响。根据bcl-2基因cDNA的序列分析,以bcl-2mRNA翻译起始区域前15个核苷酸为作用靶序列,人工合成了15聚ASON片段,同时合成15聚无关寡聚核苷酸(ODN)片段,以作序列特异性对照。把上述ASON和无关ODN片段与HL-60细胞共培养,同时设置空白对照组,作用一定时间后分别测定细胞动力学和~3H-TdR掺入率。实验发现:从3.5—30.0μmol/L的ASON对细胞生长有不同程度抑制作用,低于10μmol/L时抑制作用小,大于10.0μmol/L时抑制作用显著,浓度愈大,抑制程度愈大,而无关ODN作用组的细胞生长状态与空白对照组无显著差别,作用48小时后浓度3.5μmol/L抑制率为6％,而20.0μmol/L时上升为40％;作用96小时后3.5μmol/L的ASON抑制率是5.1％,30μmol/L的抑制率高达67％。相同浓度的ASON作用不同时间后,细胞生长率各不相同,当浓度达到14.0μmol/L时,48小时的细胞生长抑制率达22％,72和96小时的抑制率分别为25％和29.3％。HL-60细胞被ASON处理后,培养体系中死细胞数随时间延长而增加,浓度在10—30μmol/L范围内,死细胞率由2％增到50％,但在无关ODN及空白对照组中未观察到这种现象。

hTERT反义寡聚核苷酸对子宫内膜癌细胞Bcl-2蛋白含量的影响

目的观察人端粒酶逆转录酶反义寡聚脱氧核苷酸对子宫内膜癌Ishikawa细胞株Bcl-2蛋白表达含量的影响。方法将2.5μmol/L、5μmol/L及10μmol/L人端粒酶逆转录酶反义寡聚脱氧核苷酸与Ishikawa细胞株共同培养,于24、48、72 h采用MTT法检测细胞增殖,于48 h使用流式细胞仪检测细胞凋亡和Bcl-2蛋白表达。结果人端粒酶逆转录酶反义寡聚脱氧核苷酸呈时间和剂量依赖性抑制Ishikawa细胞增殖,并可呈剂量依赖性诱导Ishikawa细胞凋亡、降低Bcl-2蛋白表达量。结论人端粒酶逆转录酶反义寡聚脱氧核苷酸可以诱导Ishikawa细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖,该作用与降低Bcl-2蛋白表达量有关。

表皮生长因子受体反义寡聚核苷酸抑制人结肠癌细胞的增殖

目的:建立稳定表达反义表皮生长因子受体(EGFR)的人结肠癌细胞系,研究细胞的生物学行为.方法:应用脂质体介导法将重组克隆携带反义EGFR的逆转录病毒载体转染人结肠癌细胞系LST174,利用细胞计数、生长曲线、MTT法及软琼脂集落形成率测定细胞生长、增殖及恶性表型的转化.结果:转染稳定后的细胞易脱落,细胞膜毛糙,细胞生长呈小片状,不密集.细胞继续培养后,LST174/AS-EGFR组细胞生长受到抑制,生长曲线较LST174组速度减慢,差别显著(A值:0.322±0.014vs0.422±0.033,P<0.05);细胞生长抑制率为23.7%,LST174/AS-EGFR组细胞几乎失去了集落形成能力,且少、松散,而对照组呈叠落堆积生长.结论:反义EGFR对内源性EGFR自分泌因子表达的阻断可抑制结肠癌细胞的生长、增殖及恶性表型的转化.

硫代反义寡聚核苷酸在线性聚丙烯酰胺-毛细管电泳中的分离行为

通过对硫代反义寡聚核苷酸在毛细管线性聚丙烯酰胺胶 (LPA)中的电泳行为的研究 ,发现在 1 0 %浓度的LPA和 1 0 0mmol LTris borate及 7mol L尿素的缓冲溶液中 (pH =8.2 ) ,这类被分析物质有着较好的分离效果和重现性 ,能使相差一个碱基的硫代反义寡聚核苷酸片断得到基线分离。

侧脑室注射μ-阿片受体反义寡聚核苷酸对小鼠甲基苯丙胺行为敏化反应的影响

目的探讨μ-阿片受体(μ-opioid receptor,MOR)在小鼠甲基苯丙胺行为敏化中的作用。方法人工合成反义及错配反义MOR基因片断,通过对小鼠自主活动行为的检测,观测侧脑室注射MOR反义寡聚核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对急性甲基苯丙胺活动增强效应及慢性甲基苯丙胺诱导的小鼠行为敏化形成的影响。结果MOR ASODN可显著降低甲基苯丙胺的急性高活动效应,并可阻断甲基苯丙胺诱导小鼠行为敏化的形成。结论MOR ASODN对中枢神经系统功能具有抑制作用,可抑制甲基苯丙胺诱导小鼠行为敏化的形成过程,提示MOR介导对甲基苯丙胺的成瘾行为的调控作用。

端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞的影响

目的 :观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞株的作用。方法 :用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与人胃癌细胞株共同温育一定时间后 ,观察细胞形态变化 ,检测细胞DNA含量的分布 ,测定端粒酶活性。结果 :端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导人胃癌细胞凋亡 ,抑制端粒酶活性 ,在形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成 ;电泳呈凋亡特征性Ladder带 ;流式细胞仪分析显示 ,在G1期前出现亚 2倍体凋亡峰 ;端粒酶活性抑制。结论 :端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导胃癌细胞凋亡 ,抑制端粒酶活性 ,抑制端合成 。

端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人肝癌细胞株端粒酶活性作用的实验研究

观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对肝癌细胞株的作用。用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与肝癌细胞株共同孵育一定时间后 ,观察细胞形态变化、细胞DNA含量的分布 ,测定端粒酶活性。端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导肝癌细胞凋亡 ,抑制端粒酶活性 ,在形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成 ;电泳呈凋亡特征性Ladder带 ;流式细胞仪分析显示 ,在G1期前出现亚 2倍体凋亡峰 ;端粒酶活性抑制。端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导肝癌细胞凋亡 ,抑制端粒酶活性 ,抑制端粒合成 ,从而抑制肝癌细胞的生长。