制备脂质体包裹的^(99m)锝标记c-myc mRNA反义寡聚核苷酸的研究

探讨脂质体包裹的 99m-锝标记 c- myc m RNA反义寡聚核苷酸的制备方法 ,为反义显像和反义治疗的实验研究奠定基础。合成 15 bp的反义寡聚核苷酸 (DNA)和双功能螯合剂 -联肼尼克酰胺衍生物 ,DNA与双功能螯合剂偶联后 ,用 99m锝标记 ,然后用 C1 8Sep- Pak反相柱进行纯化 ,根据纯化结果 ,绘制淋洗曲线 ,计算标记率。再用阳离子脂质体对纯化产物进行包裹 ,获得脂质体包裹的 99m锝 - DNA。用纸层析测定脂质体包裹的 99m锝 - DNA的放射性化学纯度及与水、血清孵育后的稳定性。结果 ,不同放射性活度的 99m Tc O4 - 标记时的标记率为 :14 80 MBq时为 6 3.37%± 3.5 1% ,74 0 MBq时为 6 2 .5 2 %± 3.6 9% ,5 92 MBq时为 5 9.82 %± 5 .12 % ,经 χ2检验无显著性差异。脂质体包裹 99m Tc- DNA的放射化学纯度 =96 .4 7%± 3.0 1% ,与水、血清孵育后脱落的 99m Tc极少 ,可见 99m Tc- DNA的稳定性极好。由此可见 ,以脂质体作载体 ,联肼尼克酰胺衍生物作为双功能螯合剂 ,可制备脂质体包裹的

比较和分析NtGNL1的反义寡聚核苷酸抑制在烟草三种培养体系中的效果

为探讨反义寡聚核苷酸抑制(antisense oligodeoxynucleotides inhibition)技术在植物材料上的应用,以已知功能的NtGNL1(Nicotiana tabacum GNOM-Like1)为目标基因,寻找反义寡聚核苷酸抑制最适作用体系,并进一步分析NtGNL1的具体作用。根据目标基因mRNA序列设计反义寡聚核苷酸序列,商业合成后并将其添加到烟草胚珠、种子和花粉管离体培养的培养基中,以抑制NtGNL1的表达。结果表明,将反义寡聚核苷酸引入离体培养系统,短时间内抑制了目标基因mRNA的表达,但对胚胎发育过程的影响和种子萌发的抑制都不明显。在花粉离体萌发系统中,反义寡聚核苷酸抑制能够高效地引起目标基因mRNA的下调。对FM4-64染色的花粉管显微缩时观察发现,NtGNL1的下调能够引起囊泡分布和运输方向的改变。对花粉管膜流相关的5个基因的半定量分析也显示反义寡聚核苷酸进入花粉管后,导致3个基因的表达下调,暗示NtGNL1抑制表达会影响花粉管囊泡运输的多个节点。

c-fos反义寡聚核苷酸对亚硒酸钠引起的皮质神经元凋亡的保护作用(英文)

本文利用 c-fos ASO(反义链全部硫代磷酸化修饰 )技术阻断 c-fos的表达 ,观察此项处理对亚硒酸钠在体外培养皮质神经细胞致凋亡作用和相关基因表达改变的影响。结果显示 :( 1) c-fos ASO可阻断亚硒酸钠的致凋亡作用 ,且有一定的剂量和时间依赖性 ;用琼脂糖凝胶电泳分析由各个时间点提取的 DNA片段 ,与对照组比较 ,c-fos ASO能明显阻断亚硒酸钠诱导的典型的 DNA梯型 ;用流式细胞仪检测得到的 DNA含量直方图也显示 ,在 c-fos ASO处理后 ,与对照组比较 ,亚硒酸钠引起的亚二倍体峰变小 ;( 2 )用 RT-PCR法检测表明 ,在用 c-fos ASO和亚硒酸钠处理皮质神经细胞后 ,不仅阻断了 c-fos表达的上调 ,对其它几种基因表达的改变也有不同的影响 ,与对照组比较 ,c-fosm RNA在各个时间点 ( 0 .5、1、2、4和 2 4h)不再上升 ,bcl-2 m RNA则不再下降 ,bax m RNA和 ACh E m RNA都不再上升 ;唯一不同的是 ,p5 3m RNA的变化趋势则与未经 c-fos ASO预处理时基本相同 ,在多数时间点两组 p-5 3m RNA水平之间无显著性差异 ( P>0 .0 5 ) ,说明此基因的表达基本不受 c-fos ASO作用的影响。上述结果提示 ,亚硒酸钠诱导的神经元凋亡可能是一组级联式基因表达更变的结果 ,c-fos是其中的一个组成成员 ,它的表达改变被阻断后 ,处于它下游?

大鼠鞘内注入前强啡肽原的反义寡聚核苷酸减弱福尔马林引起的脊髓背角中强啡肽 A的合成和行为痛反应 :细胞免疫化学和行为学联合观察(英文)

应用大鼠鞘内预先注入对抗前强啡肽原表达的反义寡聚核苷酸技术 ,观察了此处理对动物后脚掌注射福尔马林 ( 5 %,1 0 0μl)诱发的行为痛反应的影响 ,同时在行为检查的 1 h后立即用免疫组化技术检测了大鼠腰髓背角 c-Fos蛋白和强啡肽 A( 1 -8)的表达。结果显示 ,上述反义寡聚核苷酸预处理可明显减弱注射福尔马林引起的行为痛反应 ,而且背角中强啡肽 A( 1 -8)表达下降 ,福尔马林引起背角 Fos蛋白合成不受影响。前已证明 ,鞘内注射对抗 c-fos的反义寡聚核苷酸 ,可以减弱福尔马林引起的痛反应 ,同时背角 Fos蛋白和强啡肽 A( 1 -8)表达量减小 ;因而本实验的结果表明 :( 1 )伤害性刺激诱导背角 Fos蛋白和强啡肽合成参与伤害性信息在脊髓的传递过程 ,Fos蛋白的合成先于强啡肽的合成。 ( 2 )在脊髓痛过敏状态的调制中 ,强啡肽是作为一种致痛因子而不是抗痛因子起作用。

鞘内注射TLR3反义寡聚核苷酸对脊神经结扎大鼠的镇痛作用

目的：探讨脊髓星形胶质细胞TLR3在神经病理性疼痛中的作用。方法：雄性SD大鼠,体重180~250 g。实验一：72只鞘内置管大鼠随机分为：生理盐水（NS）20μl＋脊神经结扎（SNL）（A组）,错义寡聚核苷酸（MM-ODN）20μg/d＋SNL（B组）,反义寡聚核苷酸（AS-ODN）20μg/d＋SNL（C组）。实验二：72只SNL后7天大鼠随机分为：SNL＋NS20μl（D组）,SNL＋MM-ODN20μg/d（E组）,SNL＋AS-ODN20μg/d（F组）。实验一和实验二分别于SNL前1天和后7天开始鞘注,每天一次,共7天;于术后-1、1、3、5、7、10、14天和-1、7、10、12、14天行行为学实验。实验一和实验二分别于术后7天和14天每组各随机取6只大鼠利用免疫组织化学法观察脊髓背角GFAP的表达,并于术后-1、3、7、14天和术后7、10、14天每组各随机取6只大鼠断头处死,取L4~5脊髓节段采用RT-PCR法测定TLR3和IL-6 mRNA的表达。结果：实验一：与A组比较,C组PWPT升高并持续至术后14天（P〈0.05）,C组各时间点PWL无明显变化（P〉0.05）;与A组和B组比较,C组脊髓背角GFAP免疫反应阳性产物表达相对面积分别下降46.4%（P〈0.01）和45.7%（P〈0.01）;与A组和B组比较,C组鞘内注射AS-ODN抑制了TLR3受体和IL-6 mRNA的表达。实验二D组、E组和F组在PWPT、PWL、GFAP表达和TLR3及IL-6 mRNA表达方面的差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：脊髓背角星形胶质细胞TLR3可能参与了神经病理性疼痛的发生与发展。

c-fos反义寡聚核苷酸对脑缺血性损伤和电针抗损伤作用的影响

用c fos反义寡聚核苷酸脑内微量注射、TTC染色、c Fos免疫组织化学和电针等技术和方法 ,探讨即早反应基因c fos在大鼠局灶性脑缺血 (MCAO)模型的脑损伤中和电针抗局灶性脑缺血脑损伤中所起的作用。实验结果表明 ,局灶性脑缺血可引起c fos在缺血侧皮质的大量表达 ,电针能部分抑制这种表达 ,使脑缺血梗死灶体积减小。在缺血中心区注射c fos反义寡聚核苷酸后 ,脑内c fos的表达基本上被完全阻断 ,导致脑梗死灶的体积明显增大 ,电针抗脑缺血脑损伤的作用也被取消。提示脑缺血后 ,脑内的c fos适度表达可能对脑损伤有一定的保护作用 ;电针可能部分抑制了脑内c fos表达 ,调整了缺血后的c fos表达的程度 ,对脑缺血损伤起一定的保护作用。

氧化铁磁性纳米颗粒作为MDR1反义寡聚核苷酸载体的构建

目的：构建磁性纳米MDR1反义探针，评价以氧化铁磁性纳米颗粒作为载体转染MDR1反义基因的可行性。方法：应用多聚赖氨酸修饰葡聚糖包裹氧化铁纳米颗粒（dextrancoatedironoxidenanopartieles），并将此复合物与肿瘤多药耐药反义基因结合。采用琼脂糖凝胶电泳分析氧化铁磁性纳米颗粒结合MDR1反义基因的能力，结合氧化铁纳米颗粒作为载体进行荧光标记的反义寡聚脱氧核苷酸（asODN）体外细胞转染实验。结果：琼脂糖凝胶电泳显示纳米氧化铁在不同的pH值及各种质量比均有良好的DNA结合能力。纳米氧化铁可作为基因载体将MDR1反义基因转染细胞，荧光显微镜可观察到发绿色荧光的细胞，普鲁士蓝铁染色观察到细胞内的蓝色铁颗粒。结论：成功构建了MDR1反义基因磁性纳米颗粒。纳米氧化铁可作为基因载体转染人细胞。

保护薇乔缝线携载反义寡聚核苷酸的实验研究

目的：探讨手术缝线携载反义基因片断的可能性及可行性，为术中血管吻合口局部转染反义基因提供新的途径。方法：保护薇乔缝线反复浸于反义核酸溶液中７２ ｈ，溴化乙锭（ＥＢ）标记，紫外灯下观察其吸附反义基因的情况。将吸附反义基因的缝线置于生理盐水中分别于不同时间点测其释放的Ｄ值，绘出体外控释曲线。同时取释放液进行电泳分析。以在荧光标记的核酸溶液中浸过的缝线直接行兔颈总动脉吻合，２４ ｈ 取材制片荧光显微镜下观察。结果：吸附核酸的保护薇乔缝线经ＥＢ标记后在紫外灯下呈烧红的铁丝样，释放曲线提示２ ｈ 释放明显增加，３６ｈ 释放达高峰。电泳则可见随时间延长而逐渐变亮的电泳带。荧光显微镜下见吻合口附近血管壁全层散在荧光分布。结论：保护薇乔缝线可较大量携载反义基因片段，可于术中血管吻合时直接将反义基因转移至吻合口并缓慢释放。

表皮生长因子受体反义寡聚核苷酸抑制人结肠癌细胞的增殖

目的:建立稳定表达反义表皮生长因子受体(EGFR)的人结肠癌细胞系,研究细胞的生物学行为.方法:应用脂质体介导法将重组克隆携带反义EGFR的逆转录病毒载体转染人结肠癌细胞系LST174,利用细胞计数、生长曲线、MTT法及软琼脂集落形成率测定细胞生长、增殖及恶性表型的转化.结果:转染稳定后的细胞易脱落,细胞膜毛糙,细胞生长呈小片状,不密集.细胞继续培养后,LST174/AS-EGFR组细胞生长受到抑制,生长曲线较LST174组速度减慢,差别显著(A值:0.322±0.014vs0.422±0.033,P<0.05);细胞生长抑制率为23.7%,LST174/AS-EGFR组细胞几乎失去了集落形成能力,且少、松散,而对照组呈叠落堆积生长.结论:反义EGFR对内源性EGFR自分泌因子表达的阻断可抑制结肠癌细胞的生长、增殖及恶性表型的转化.

硫代反义寡聚核苷酸在线性聚丙烯酰胺-毛细管电泳中的分离行为

通过对硫代反义寡聚核苷酸在毛细管线性聚丙烯酰胺胶 (LPA)中的电泳行为的研究 ,发现在 1 0 %浓度的LPA和 1 0 0mmol LTris borate及 7mol L尿素的缓冲溶液中 (pH =8.2 ) ,这类被分析物质有着较好的分离效果和重现性 ,能使相差一个碱基的硫代反义寡聚核苷酸片断得到基线分离。

侧脑室注射μ-阿片受体反义寡聚核苷酸对小鼠甲基苯丙胺行为敏化反应的影响

目的探讨μ-阿片受体(μ-opioid receptor,MOR)在小鼠甲基苯丙胺行为敏化中的作用。方法人工合成反义及错配反义MOR基因片断,通过对小鼠自主活动行为的检测,观测侧脑室注射MOR反义寡聚核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对急性甲基苯丙胺活动增强效应及慢性甲基苯丙胺诱导的小鼠行为敏化形成的影响。结果MOR ASODN可显著降低甲基苯丙胺的急性高活动效应,并可阻断甲基苯丙胺诱导小鼠行为敏化的形成。结论MOR ASODN对中枢神经系统功能具有抑制作用,可抑制甲基苯丙胺诱导小鼠行为敏化的形成过程,提示MOR介导对甲基苯丙胺的成瘾行为的调控作用。

c-fos,bax和p53的反义寡聚核苷酸(ASOs)对溶血磷脂酸所致的培养小鼠大脑皮层神经元凋亡的影响(英文)

溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)在高浓度时( >50μmol/L)显示出对培养大脑皮层神经元致凋亡特性。本研究旨在初步分析溶血磷脂酸致凋亡过程中对相关基因表达的依赖性,在研究中结合琼脂糖电泳,HO33342染色和TUNEL技术观察c-fos,bax和p53三种反义寡聚核苷酸对溶血磷脂酸致培养大脑皮层神经元致凋亡的影响。结果显示结合c-fos, bax和p53三种反义寡聚核苷酸均表现出对溶血磷脂酸致凋亡的神经保护作用。溶血磷脂酸的致凋亡过程为c-fos,bax和p53基因依赖性,不同于b淀粉样蛋白片段31 -35的致凋亡特性。

反义寡聚核苷酸的化学修饰

反义寡聚核苷酸(antisense oligonucleotides, AS-ODNs)的概念最先提出于1967年,经过30多年的研究,人们已意识到在各种反义寡聚核苷酸的广阔领域里,有可能寻找到更有效的抗病毒和抗肿瘤新药.

反义寡聚核苷酸抗单疱病毒及治疗单疱病毒性角膜炎的作用

本文介绍了反义寡聚核苷酸的概念和作用机制，以及HSV－1的基因结构和功能。同时阐述了反义寡聚核音酸在HSV－1基因上的作用位点及其在细胞水平的抗病毒作用和治疗动物单疮病毒性角膜炎的结果。反义寡聚核着酸有望作为新型药物应用于临床。

纳米反义寡聚核苷酸（ASO）美白技术

纳米反义寡聚核苷酸（ASO）美白技术是继基因克隆和重组技术之后在分子生物学领域中兴起的一门全新的基因工程技术。一个ASO分子通常含有20个左右的核苷酸，实际上它是与体内特定的基因互补的一小段核苷酸序列。由于互补性，ASO分子可以与致病（或致黑）基因特异结合并阻断特定致病基因的表达．通过影响基因的转录或翻译抑制该基因编码蛋白质的过度合成。例如研究认为一些深色皮肤组织中某一与黑色素有关的特定基因的过度表达，能够产生过多的黑色素．抑制这些特定基因的过度表达就可以抑制黑色素产生借此达到美白、祛斑的效果。

反义寡聚核苷酸治疗支气管哮喘的实验研究

目的 探讨反义寡聚核苷酸治疗支气管哮喘的可能性及效果。方法 根据小鼠IL 5cDNA序列设计合成反义寡聚核苷酸片段 ,用T4 噬菌体多核苷酸激酶标记反义寡聚核苷酸的 5′端 ,观察硬脂胺 (SA)脂质体对反义寡聚核苷酸的转染效率的影响。用卵蛋白和氢氧化铝复制哮喘模型。用聚酰纤维分离小鼠脾T淋巴细胞进行体外培养并导入由阳离子脂质体携带的不同浓度的反义寡聚核苷酸 ,观察其对T淋巴细胞合成IL 5的影响。采用酶联免疫吸附 (ELISA)法测定细胞培养上清液中IL 5浓度。结果 SA脂质体能显著提高反义寡聚核苷酸的转染效率 ,1∶15m/m(反义寡聚核苷酸和SA脂质体质量比 )时转染效率最佳 ,提高反义寡聚核苷酸转染效率 12倍。未经卵蛋白刺激的正常鼠和哮喘鼠T淋巴细胞培养上清液中未测到IL 5 ,经卵蛋白刺激后 ,T淋巴细胞培养上清液中IL 5含量明显增高。导入不同浓度的反义寡聚核苷酸 (10、2 0及 30 μmol/L)后 ,脾T淋巴细胞合成IL 5明显降低 ,细胞培养上清液中IL 5含量由 (4 4.6 0± 6 .2 3)pg/ml分别降低到 (30 .70± 7.36 2 )、(17.2 0± 6 .181)和 (8.16± 2 .34) pg/ml,抑制IL 5合成百分率分别为 31.17%、6 1.43%和81.7%。结论 反义寡聚核苷酸可明显抑制IL 5的合成 ,且呈明显的量效关系。

PCNA的反义寡聚核苷酸抑制子宫颈癌HeLa细胞的研究

目的 检测脂质体介导增殖细胞核抗原 (PCNA)反义寡聚核苷酸抑制子宫颈癌细胞体外增殖活性效果。方法 应用细胞生长曲线和MTT比色法检测细胞增殖活性 ,并采用免疫组织化学方法 (SABC法 )检测PCNA蛋白的表达。结果 反义寡聚核苷酸处理组细胞与对照组比较生长曲线差异有显著性 ,增殖显著受抑 (P <0 0 5 ) ,PCNA蛋白表达完全抑制。而正义寡聚核苷酸组则无此作用 (P >0 0 5 )。结论 提示PCNA反义寡聚核苷酸可以显著抑制子宫颈癌细胞体外增殖活性 。

hTERT反义寡聚核苷酸对子宫内膜癌细胞Bcl-2蛋白含量的影响

目的观察人端粒酶逆转录酶反义寡聚脱氧核苷酸对子宫内膜癌Ishikawa细胞株Bcl-2蛋白表达含量的影响。方法将2.5μmol/L、5μmol/L及10μmol/L人端粒酶逆转录酶反义寡聚脱氧核苷酸与Ishikawa细胞株共同培养,于24、48、72 h采用MTT法检测细胞增殖,于48 h使用流式细胞仪检测细胞凋亡和Bcl-2蛋白表达。结果人端粒酶逆转录酶反义寡聚脱氧核苷酸呈时间和剂量依赖性抑制Ishikawa细胞增殖,并可呈剂量依赖性诱导Ishikawa细胞凋亡、降低Bcl-2蛋白表达量。结论人端粒酶逆转录酶反义寡聚脱氧核苷酸可以诱导Ishikawa细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖,该作用与降低Bcl-2蛋白表达量有关。

阳性脂质体介导反义寡聚核苷酸转染HeLa细胞的效果研究

采用FITC标记的未经修饰的和经过修饰的两种19-mer反义寡聚核苷酸序列(ODN19和S-ODN19)作为转染物质,用流式细胞技术(FCM)研究比较几种常用阳性脂质体介导的寡聚核苷酸转染HeLa细胞的效果及适宜的转染时间。未经化学修饰的ODN19转染结果显示,LipofectAmine和DM-RIE-C增强转染的作用相对较强,而其他两种脂质体的作用并不明显。对于经过修饰的S-ODN19转染而言,四种阳性脂质体均具有增强S-ODN19转染作用,但以LipofectAmine的效果最为明显,其转染效果(FITC均值为5203.11)为无脂质体介导对照的数十倍。四种阳性脂质体的增强转染作用排序为:LipofectAmine>FuGENE6>Lipofectin>DM-RIR-C。另外,在用FuGENE6介导寡聚核苷酸转染时,采用4小时转染时间可获较好转染效果。