Midkine反义寡聚脱氧核苷酸对糖尿病肾病大鼠肾脏CTGF表达水平的影响

目的:研究中期因子(MK)反义寡聚脱氧核苷酸(AS-ODNs)对早期糖尿病肾病(DN)大鼠肾脏结缔组织生长因子(CTGF)表达水平的影响,揭示MK AS-ODNs在早期DN中的治疗前景。方法:将SD大鼠完全随机分为正常组、DN组和MK AS-ODNs组各20只,DN组和MK AS-ODNs组行单肾切+高糖高脂饲料+链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型。成模第6周,MK AS-ODNs组尾静脉注射MK AS-ODNs,正常组和DN组予等量生理盐水,干预4 d后处死并留取肾脏组织,利用实时荧光定量PCR技术检测肾脏组织MK及CTGF的表达情况。结果:DN组大鼠肾脏MK和CTGF的表达水平较正常组明显增多且差异有统计学意义(P<0.05);MK AS-ODNs组大鼠肾脏MK和CTGF的表达水平较DN组明显减少且差异有统计学意义(P<0.05);MK与CTGF在大鼠肾脏组织的表达呈正相关(r=0.498,P<0.05)。结论:早期DN大鼠肾脏MK和CTGF的表达增多,MK AS-ODNs通过抑制MK的合成降低CTGF的表达水平,延缓DN进展。

c-fos基因的反义寡聚脱氧核苷酸鞘内注入减弱福尔马林引起的大鼠伤害性行为反应及脊髓背角Fos蛋白和强啡肽 A表达的研究(英文)

本研究通过鞘内注射 c-fos反义寡聚脱氧核苷酸 (antisense oligodeoxynucleotide,AS-ODN)封闭背角中 F os蛋白的表达 ,观察了 Fos蛋白合成和慢痛反应的关系 ,并分析 Fos蛋白合成和强啡肽 A(Dyn A)表达之间的关系。实验组动物 (n=5 )鞘内预先注射 c-fos的 AS-ODN(5 0μg,5μl) ,另两个对照组 (每组 n=5 )分别注射等量生理盐水和 AS-ODN的反序核苷酸 (reverseoligodeoxynucleotides,RS-ODN,5 0μg,5μl) ;4h后 ,各组动物均在一侧后肢脚掌皮下注射 formalin(5 % ,5 0μl) ,并立即用计算动物舔拭注射侧后脚掌累计时间的方法 ,检测大鼠的伤害性行为反应 ,行为检测后 1h处死动物 ,用免疫组化方法检查脊髓背角中 Fos蛋白阳性神经元的数量和强啡肽 A(1～ 8)的表达量。结果发现 ,和两个对照组相比 ,实验组动物 Formalin诱发的伤害性行为反应的第二相明显减弱 ,同时 Form alin注射侧背角 F os蛋白样免疫阳性细胞的数量和 Dyn A含量的灰度值明显减少。本研究结果提示 ,外周伤害性刺激引起的长期持续的痛反应是以 c-fos基因表达增加及受其调控的 Dyn A表达上调为基础的 ,由此推测在脊髓背角神经元中 Fos蛋白和 Dyn

反义ras寡聚脱氧核苷酸对血管平滑肌细胞生物学行为的影响

为了研究调控小分子G蛋白（ras蛋白）以抑制血管平滑肌细胞对生长因子的反应机制，用合成的反斗ras寡聚脱氧核苷酸作用于碱性纤维母细胞生长因子以刺激培养的大鼠血管平滑肌细胞，通过鼠标胸腺嘧啶脱氧核苷酸掺入法及免疫细胞化学方法，来观察反斗ras聚脱氧核苷酸对在碱性纤维母细胞生长因子刺激下的大鼠血管平滑肌细胞DNA合成和增殖细胞核抗原的影响。结果发现，反义ras寡策脱氧核苷酸可明显抑制血管平滑肌细胞DNA的合成，作用12h和24h的抑制率分别为92％和90％；而相同浓度的正义链组仅呈现较弱的抑制作用（P＜0．01）．反义ras寡聚脱氧核苷酸亦可显著减少血管平滑肌细胞增殖细胞核抗原蛋白的表达．提示该策略的应用有可能解决以生长因子为始因引起的细胞增殖性疾病、经文腔内冠状动脉成形术后再狭窄、动脉粥样硬化及高血压等问题的临床防治．

Survivin反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞生长的抑制

目的：观察survivin反义寡聚脱氧核苷酸（antisense oligodeoxynueleotide，ASODN）对人胃癌细胞株SGC-7901的抑制作用。方法：用ASODN与人胃癌细胞SGC-7901共同温育一定时间后，PCR检测ASODN处理后肿瘤细胞survivin mRNA的表达，倒置显微镜、电镜观察细胞生长形态变化，DNA电泳检测细胞DNA片段化分布，流式细胞术检测ASODN作用后人胃癌细胞SGC-7901的凋亡，TRAP法测定细胞端粒酶活性，MTT法检测ASODN对胃癌细胞增殖的抑制；上述实验以胃癌细胞不加ASODN和加无关寡聚脱氧核苷酸为对照。结果：ASODN作用后，肿瘤细胞survivin mRNA的表达受到明显抑制。survivin ASODN能诱导人胃癌细胞凋亡，在形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成；电泳呈凋亡特征性ladder条带；流式细胞术分析显示，在G1期前出现亚2倍体凋亡峰，肿瘤细胞凋亡率显著增高[（7．01±0、21）％ vs （25．00±0．52）％，P〈0．01]。ASODN作用后SGC-7901细胞端粒酶活性明显受到抑制（P〈0．01）。ASODN作用能明显抑制胃癌细胞的增殖，而且随ASODN浓度的增加（2×10^-5－5×10^-5mol／L）和作用时间延长（24－96h）而加强（P〈0．05或P〈0．01）。结论：survivin反义寡聚脱氧核苷酸能诱导胃癌细胞凋亡，从而抑制胃癌细胞的增殖。

反义寡聚脱氧核苷酸（ODN）衍生物抑制乙肝病毒抗原表达的研究

为比较针对中不同基因的ＯＤＮ硫代衍生物阻断乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的抗原表达，合成了与核心蛋白编码基因起始码上游序列（＃１８９３－１９０７），多聚酶蛋白编码基因起始码上游及内部序列（＃２２９７－２３１３，＃２７９７－２８１３）３．５ｋｂＲＮＡ３′端起始负链ＤＮＡ合成序列（＃ｌ８１７－１８３１）互补的寡聚脱氧核苷酸硫代衍生物［Ｃ－ＯＤＮ，Ｐ－ＯＤＮ，ＰＭ－ＯＤＮ，ＰＢＳ－ＯＤＮ］，分别在ＨＢＶ短暂表达和稳定表达细胞培养系统中观察其抑制ＨＢＶ抗原表达的作用。结果发现，当培养液中ＯＤＮ浓度为２０μｍｏｌ／Ｌ时，四种ＯＤＮ均能抑制ＨｅｐＧ２２．２．１５细胞ＨＢｓＡｇ（乙肝表面抗原）的产生（抑制率分别为：Ｃ－ＯＤＮ，２４．５％；ＰＯＤＮ，１３．４％；ＰＭ－ＯＤＮ，３８．４％；ＰＢＳ－ＯＤＮ，２８．４％）；与ＨＢＶＤＮＡ双体质粒共转染ＨｅｐＧ２细胞后部分ＯＤＮ可明显抑制ＨＢＶＤＮＡ在细胞内表达（ＨＢｅａｇ分泌抑制率分别为：Ｃ－ＯＤＮ，５２％；ＰＭ－ＯＤＮ，７０％；Ｐ－ＯＤＮ，４８％；ＰＢＳ－ＯＤＮ，１８％）。用测定上清中人白蛋白的结果证明，Ｃ－ＯＤＮ的细胞毒作用最低。对Ｃ－ＯＤＮ的作用机理及进一步发展ＯＤＮ的应用也进行了?

c-Ha-ras和c-myc反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞生长增殖的影响

作者观察了人工合成的反义c-Ha-ras和 c-myc寡聚脱氧核昔酸(ASO-r,ASO-m)对两株胃癌细胞中Ha-ras癌基因表达和细胞生长增殖的影响。观察到ASO-r能显著抑制MGc-803细胞P21蛋白合成(作用12 h抑制率达48.10％,P<0.01),同时对其DNA合成和细胞增殖也有较显著的抑制作用(抑制率分别为76.79％,55.61％,P<0.05)。ASO-r对SGc-7901细胞的DNA合成和细胞增殖也有类似的抑制作用(抑制率分别为76.78％,62.02％,P<0.05)。ASO-m对两株细胞的细胞增殖和SGc-7901细胞DNA合成均无明显影响,仅对MGc-803细胞的DNA合成有抑制作用(抑制率为71.37％,P<0.05)。结果表明:ASO-r能够阻断c-Ha-ras癌基因表达,并抑制胃癌细胞生长增殖;c-Ha-ras癌基因可能是维持胃癌细胞恶性生长表型的主要因素。

端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人肝癌细胞的作用

目的 观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人肝癌细胞株的作用。方法 用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与人肝癌细胞株共同温育一定时间后 ,观察细胞形态变化 ,检测细胞DNA含量的分布 ,测定端粒酶活性。结果 端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导人肝癌细胞凋亡 ,抑制端粒酶活性 ,在形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成 ;电泳呈凋亡特征性Ladder带 ;流式细胞仪分析显示 ,在G1 期前出现亚二倍体凋亡峰 ;端粒酶活性抑制。结论 端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导肝癌细胞凋亡 ,抑制端粒酶活性 ,抑制端粒合成 。

bcl-2反义寡聚脱氧核苷酸抑制HL-60细胞生长的研究

在体外培养中研究了基因的反义寡聚脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleo-tide,ASON)对HL-60细胞生长增殖的影响。根据bcl-2基因cDNA的序列分析,以bcl-2mRNA翻译起始区域前15个核苷酸为作用靶序列,人工合成了15聚ASON片段,同时合成15聚无关寡聚核苷酸(ODN)片段,以作序列特异性对照。把上述ASON和无关ODN片段与HL-60细胞共培养,同时设置空白对照组,作用一定时间后分别测定细胞动力学和~3H-TdR掺入率。实验发现:从3.5—30.0μmol/L的ASON对细胞生长有不同程度抑制作用,低于10μmol/L时抑制作用小,大于10.0μmol/L时抑制作用显著,浓度愈大,抑制程度愈大,而无关ODN作用组的细胞生长状态与空白对照组无显著差别,作用48小时后浓度3.5μmol/L抑制率为6％,而20.0μmol/L时上升为40％;作用96小时后3.5μmol/L的ASON抑制率是5.1％,30μmol/L的抑制率高达67％。相同浓度的ASON作用不同时间后,细胞生长率各不相同,当浓度达到14.0μmol/L时,48小时的细胞生长抑制率达22％,72和96小时的抑制率分别为25％和29.3％。HL-60细胞被ASON处理后,培养体系中死细胞数随时间延长而增加,浓度在10—30μmol/L范围内,死细胞率由2％增到50％,但在无关ODN及空白对照组中未观察到这种现象。

端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞的影响

目的 :观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞株的作用。方法 :用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与人胃癌细胞株共同温育一定时间后 ,观察细胞形态变化 ,检测细胞DNA含量的分布 ,测定端粒酶活性。结果 :端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导人胃癌细胞凋亡 ,抑制端粒酶活性 ,在形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成 ;电泳呈凋亡特征性Ladder带 ;流式细胞仪分析显示 ,在G1期前出现亚 2倍体凋亡峰 ;端粒酶活性抑制。结论 :端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导胃癌细胞凋亡 ,抑制端粒酶活性 ,抑制端合成 。

端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人肝癌细胞株端粒酶活性作用的实验研究

观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对肝癌细胞株的作用。用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与肝癌细胞株共同孵育一定时间后 ,观察细胞形态变化、细胞DNA含量的分布 ,测定端粒酶活性。端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导肝癌细胞凋亡 ,抑制端粒酶活性 ,在形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成 ;电泳呈凋亡特征性Ladder带 ;流式细胞仪分析显示 ,在G1期前出现亚 2倍体凋亡峰 ;端粒酶活性抑制。端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导肝癌细胞凋亡 ,抑制端粒酶活性 ,抑制端粒合成 ,从而抑制肝癌细胞的生长。

反义寡聚脱氧核苷酸抑制脑胶质瘤多药耐药基因1的表达

目的研究多药耐药基因1(M D R1)反义寡聚脱氧核苷酸对胶质瘤耐药细胞系C6/adr中M D R1表达的抑制作用。方法以胶质瘤细胞株C6/adr作为胶质瘤体外耐药模型,针对M D R1基因m R NA的A UG起始区-9～+6序列合成反义和相应的正义寡聚脱氧核苷酸,均经硫代磷酸化修饰。反义寡聚脱氧核苷酸(M D R1-AS)序列为5'-CTCCATCA CCAC CTC-3',正义寡聚脱氧核苷酸(M D R1-S)序列为5'-G AG GTG G TG ATG G AG-3'。在脂质体介导下M DR1-A S、M D R1-S转染C6/adr细胞,48h后利用形态学观察和噻唑蓝快速比色法检测M D R1-AS的细胞毒性作用;半定量R T-PCR检测M DR1-A S处理前后的M DR1m RN A的差异表达;流式细胞术分析P糖蛋白(P-gp)的阳性细胞率。结果M D R1-AS对C6/adr细胞无毒性作用;M D R1-AS处理后M D R1m RN A的差异表达由处理前的106%降至30.44%;P-gp阳性表达率亦由处理前的100%降至32.77%。结论M D R1反义寡聚脱氧核苷酸可有效抑制M D R1m R N A及P-gp的表达,从而为基因治疗耐药胶质瘤提供了实验依据,有望开发成为逆转胶质瘤耐药的反义药物。

端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对子宫内膜癌细胞株的影响

目的观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对癌细子宫内膜癌细胞株的作用。方法用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与子宫内膜细胞株共同温育一定时间后,观察细胞形态变化,检测细胞Bcl-2蛋白表达情况,测定端粒酶活性。结果端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导子宫内膜癌细胞凋亡,抑制端粒酶活性,在形态学上表现为出现细胞质浓缩,变圆,核染色不均匀,核物质边聚成新月形或块壮;电泳呈凋亡特征性Ladder带;流式细胞仪分析显示,反义寡核苷酸在细胞进入DNA合成期前引起DNA损伤,使细胞停滞在G0～G1期,并诱导细胞凋亡。结论端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能抑制端粒酶活性,诱导子宫内膜癌细胞凋亡,从而抑制子宫内膜癌的增殖。

DNA聚合酶α反义寡聚脱氧核苷酸抑制人胃癌细胞生长的研究

反义药物的研究为肿瘤的特异性治疗开拓了广阔的前景。DNA聚合酶α是真核细胞DNA合成的关键酶,与肿瘤的发生及发展密切相关。我们用DNA聚合酶α(DNA pol-α)mRNA作靶核酸,合成反义聚脱氧核苷酸(ASODN),作用于胃癌细胞系SGC-7901和MGC-803,结果发现互补于pol-α mRNA翻译起始区的ASODN可特异地抑制二株人胃癌细胞系的生长,而对正常人脐静脉内皮细胞则不起作用。流式细胞仪分析癌细胞G0/1期比率升高,S期及G2M期比率降低,说明ASODN通过抑制DNA pol-α表达而抑制了细胞DNA合成。

端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸诱导人肝癌细胞凋亡模型构建的实验研究

目的 观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人肝癌细胞株的作用。方法 用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与人肝癌细胞株共同孵育一定时间后 ,观察细胞形态变化 ,观察细胞 DNA含量的分布 ,测定端粒酶活性。结果 端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导人肝癌细胞凋亡 ,抑制端粒酶活性 ,在形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成 ;电泳呈凋亡特征性 Ladder带 ;流式细胞仪分析显示 ,在 G1期前出现亚 2倍体凋亡峰 ;端粒酶活性抑制。结论 端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导肝癌细胞凋亡 ,抑制端粒酶活性 ,抑制端粒成 ,从而抑制肝癌细胞的生长。

端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞株的影响

目的观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞株的作用。方法用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与人胃癌细胞株共同温育一定时间后,观察细胞形态变化,检测细胞DNA含量的分布,测定端粒酶活性。结果端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导人胃癌细胞凋亡,抑制端粒酶活性,在形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成;电泳呈凋亡特征性Ladder带;流式细胞仪分析显示,在G1期前出现亚二倍体凋亡峰,端粒酶活性抑制。结论端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能抑制端粒酶活性,诱导胃癌细胞凋亡,从而抑制胃癌细胞的增殖。

反义寡聚脱氧核苷酸抗K562细胞的实验研究

针对慢性粒细胞白血病(CML)特征基因bcr/abl的嵌合位点和CML相关癌基因c-myb的第2外显子分别设计、合成的反义寡聚脱氧核苷酸asODN及其硫代磷酸化修饰物s-asODN分别或联合作用于慢性粒细胞白血病细胞株K562.结果表明各种asODN可显著抑制K562细胞的存活,最大抑制率为64.7%±3.2%,可显著抑制K562细胞的DNA合成,最大抑制率为85.8%±4.1%,可显著降低甚至几乎完全抑制bcr/abl的转录,可显著诱导K562发生凋亡.s-asODN的作用效果显著优于未加修饰的对应asODN.联合使用bcr/abl与c-myb的ASO比单独使用其中之一效果更佳.各种作用效果均表现出片断、时间相关性.这些说明,bcr/abl在CML发病机制中起双重作用,不仅刺激了CML细胞的过度增殖,而且抑制了细胞的凋亡.c-myb可能主要通过对bcr/abl的调控而与CML相关.asODN修饰物及多个癌基因的asODN联合使用可能是反义基因治疗的发展方向.

端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对MGC-803胃癌细胞的影响

目的探讨端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸(antisense oligodeoxy nucleotides,ASODN)对MGC-803胃癌细胞端粒酶活性及细胞生长的影响。方法将实验分为正常对照组、端粒酶正义寡聚脱氧核苷酸(sense oligodeoxy nucleotides,SODN)组和不同剂量的ASODN组;脂质体介导的ASODN和SODN作用于MGC-803细胞后,分别采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)、酶联免疫吸附法(ELISA)、吖啶橙染色法、流式细胞术检测细胞的体外增殖、端粒酶活性、细胞形态、细胞凋亡和细胞周期的改变。结果转染48h后,终浓度为1、3及5μmol/L的ASODN对MGC-803细胞端粒酶活性及细胞的增殖均有抑制作用,与正常对照组比较差异显著(P<0.01),并呈一定剂量依赖性;流式细胞仪检测到凋亡峰,细胞被阻滞在G1/S期;吖啶橙染色后光镜下观察发现有典型的凋亡小体。结论以端粒酶RNA模板区为靶点的ASODN明显抑制MGC-803胃癌细胞的增殖,其机制可能是通过降低细胞的端粒酶活性而诱发细胞的凋亡,ASODN对胃癌的治疗具有重要价值。

内皮素反义寡聚脱氧核苷酸抑制肾小球系膜细胞增殖

目的 :应用反义寡核苷酸技术 ,对培养的人肾小球系膜细胞 (glomerularmesangialcells,GMC)进行内皮素 1(endothelin ,ET 1)基因表达的抑制试验 ,探讨ET 1基因表达与GMC增殖效应的关系。方法 :以阳离子脂质体lipofectin介导的基因转移方法 ,将前内皮素原 ppET 1的反义寡聚脱氧核苷酸 (antisenseoligodeoxynucleotide ,As ODN)及其对照序列正义寡聚脱氧核苷酸 (senseoligodeoxynucleotide ,Se ODN)、错配寡聚脱氧核苷酸 (mismatcholigodeoxynucleotide ,Mis ODN)分别导入GMC。通过生物素标记的As ODN显色反应 ,观察寡聚脱氧核苷酸的转移效果 ;用半定量反转录聚合酶链反应 (reversetranscription polymerasechainreaction ,RT PCR)检测寡核苷酸链对GMC的 ppET 1mRNA表达的影响 ;用放射免疫分析 (radioimmunoassay ,RIA)观察寡核苷酸链对GMC的ET 1蛋白分泌的作用 ;用氮蓝四唑盐 (MTT)试验分析寡核苷酸链对GMC增殖的效应。结果 :寡核苷酸链被转移入GMC。10nmol·L-1As ODN抑制了GMC的 ppET 1mRNA表达、ET 1蛋白合成和细胞增殖 (各组P <0 .0 5 )。 结论 :特异抑制GMC的 ppET 1基因表达能够抑制其增殖 ,证实GMC产生的ET 1能刺激GMC自身的增殖 ,ET 1是GMC自分泌炎症介质之一。

端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸诱导人胃癌细胞凋亡模型构建的研究

目的：观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对胃癌细胞株的作用。方法：用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与胃癌细胞株共同孵育一定时间后，观察细胞形态变化，观察细胞DNA含量的分布，测定端粒酶活性。结果：端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导胃癌细胞凋亡，抑制端粒酶活性，在形态学上表现为细胞膜起泡，染色质固缩，核碎裂，凋亡及小体形成；电泳呈凋亡特征性Ladder带；流式细胞仪分析显示，在D1期前出现亚2倍体凋亡峰；端粒酶活性抑制。结论：端粒酶反义寡取脱氧核苷酸能诱导胃癌细胞凋亡，抑制端粒酶活性，抑制端粒合成，从而抑制胃癌细胞的生长。

纳米反义寡聚核苷酸（ASO）美白技术

纳米反义寡聚核苷酸（ASO）美白技术是继基因克隆和重组技术之后在分子生物学领域中兴起的一门全新的基因工程技术。一个ASO分子通常含有20个左右的核苷酸，实际上它是与体内特定的基因互补的一小段核苷酸序列。由于互补性，ASO分子可以与致病（或致黑）基因特异结合并阻断特定致病基因的表达．通过影响基因的转录或翻译抑制该基因编码蛋白质的过度合成。例如研究认为一些深色皮肤组织中某一与黑色素有关的特定基因的过度表达，能够产生过多的黑色素．抑制这些特定基因的过度表达就可以抑制黑色素产生借此达到美白、祛斑的效果。