ACC合酶cDNA克隆及其对美洲黑杨体内乙烯产生的反义抑制

利用ＲＴＰＣＲ技术克隆了大豆ＡＣＣ合酶基因ＧＭＣＡＣＣＳＩ编码区１５ｋｂ的ｃＤＮＡ片段，经酶切图谱分析和序列分析鉴定后，反向插入到２元载体ｐＢｉｎ４３８中，构建了表达ＡＣＣ合酶反义ＲＮＡ的植物表达载体，转化农杆菌后用该农杆菌侵染美洲黑杨叶片，在含卡那霉素的ＭＳ培养基上选择转化子和植株再生，通过ＰＣＲ检测从抗卡那植株中选到１５株转基因植株，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析初步确证了外源基因是以单拷贝插入到杨树基因组ＤＮＡ中；对杨树幼苗乙烯释放的测定结果表明转基因杨树幼苗的乙烯释放量为对照的２２％。

反义抑制MnSOD转基因拟南芥构建及其抑制效果的分析

为阐明植物的线粒体MnSOD在逆境适应性反应中的作用,本研究利用分子生物学技术,以拟南芥Mn-SOD基因上游序列构建其反义序列表达载体,转化拟南芥获得转基因植株。经Northern b lot鉴定发现转基因拟南芥MnSOD mRNA水平降低,NBT法检测转基因拟南芥MnSOD活性下降,表明该反义DNA序列对MnSOD基因表达具有明显的抑制效果。

乙肝反义抑制治疗的研究进展

反义RNA是一种能与mRNA分子互补的RNA,可特异抑制某一mRNA的加工、翻译以及DNA的复制,特异阻断该基因的表达。 反义RNA最早在原核细胞中被发现,随后证实反义抑制为原核细胞基因表达调控的一种方式。在真核细胞中,直到1986年Williams等才首次在小鼠基因组中观察到RNA互补区,证实了真核细胞中反义抑制的存在。反义RNA的主要作用位点如下:①mRNA5’端非编码区,包括SD序列及核糖体结合位点;②mRNA5’编码区,包括起始AUG;③mRNA5’末端cap形成位点;④pre-mRNA外显子与内含子结合部位;⑤mRNApoly-A形成位点;⑥DNA复制的RNA引物;⑦外显子内部等。 反义RNA通过与RNA互补结合,在RNA的转录、蛋白质的翻译。

化学修饰的寡核苷酸作为基因表达的反义抑制剂

本文综述了反义寡核苷酸作为基因表达抑制剂的原理和作用机理，作为人类疾病治疗剂的寡核苷酸必须具备的性质。介绍了化学修饰的寡核苷酸的种类、性质和目前已达到的研究及应用水平。

反义抑制Survivin表达增强肝癌细胞系对阿霉素的敏感性

背景与目的:由于Survivin在大多数肿瘤细胞中过表达,而在正常成人终末分化组织中沉默,并参与了恶性肿瘤的发生、发展和化疗耐药,使其成为值得关注的抗癌治疗靶。反义寡核苷酸可用来封闭凋亡抑制基因Survivin,诱导肿瘤细胞凋亡或增强其化疗敏感性。本研究旨在探讨反义抑制Survivin表达对肝癌细胞系阿霉素敏感性的影响。方法:RT鄄PCR、Westernblot检测HepG2和HepG2/ADM细胞Survivin表达;MTT法评估HepG2和HepG2/ADM对反义复合物和阿霉素的敏感性;不同浓度的反义复合物分别转染HepG2和HepG2/ADM细胞,RT鄄PCR检测SurvivinmRNA表达;等辐射分析法评估不同浓度反义复合物和亚致死浓度阿霉素对HepG2和HepG2/ADM细胞的协同效应;流式细胞术检测激活型Caspase鄄3表达及凋亡率。结果:HepG2/ADM细胞SurvivinmRNA是HepG2细胞的15倍,蛋白水平是HepG2的18倍。两种细胞均显示对反义复合物敏感并呈浓度依赖关系,反义复合物对HepG2和HepG2/ADM细胞的IC50分别为317.90nmol/L和480.74nmol/L,在500nmol/L时抑制率达到71.10%和53.67%。ADM对HepG2和HepG2/ADM细胞的IC50分别为0.36μg/ml和2.12μg/ml,耐药指数为6。反义复合物剂量依赖性下调HepG2和HepG2/ADM细胞SurvivinmRNA表达,对HepG2和HepG2/ADM细胞的IC50分别为271.93nmol/和365.72nmol/L,400nmol/L时表达水平分别下调了69.12%和60.01%。反义复合物和低浓度ADM联合使HepG2细胞的敏感性增加了6倍,使HepG2/ADM细胞的敏感性增加了4倍。联合处理激活了HepG2/ADM细胞Caspase鄄3活性,诱导细胞凋亡,激活型Caspase鄄3和凋亡率随反义复合物浓度的增加而逐渐递增。结论:反义抑制Survivin表达增强肝癌细胞系对阿霉素的敏感性,反义寡核苷酸和阿霉素联合可能是耐阿霉素肝细胞癌临床治疗的一种合理策略。

Isis的反义抑制剂前景乐观

Isis制药公司及其合作者在美国佛罗里达州奥兰多市召开的第64届美国糖尿病协会科学会议上宣布，其四种第二代反义抑制剂在鉴别新型糖尿病和相关代谢疾病药物开发靶点的临床前功效研究方面获得了乐观的数据。

短期服用一种载脂蛋白B反义抑制剂有效地减少载脂蛋白B和低密度脂蛋白胆固醇

背景:载脂蛋白B(apoB)是低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)一种重要的结构成分,并且在LDL-C的转运和清除中起着关键作用。期望通过减少apoB的合成来降低循环中LDL-C,后者为心血管疾病的已知危险因素。

反义寡核苷酸抑制肿瘤细胞表达VEGF的研究

研究用反义寡核苷酸（ＯＤＮ）抑制肿瘤细胞ＶＥＧＦ的表达，探讨发展新的抗肿瘤药物的可能性。方法Ｓ１８０细胞培养上清液有促进牛脐血管内皮细胞生长的作用。用ＶＥＧＦ的反义ＯＤＮｓ分别加入Ｓ１８０细胞培养液，检查各上清液刺激内皮细胞生长的受抑情况，即可了解ＯＤＮｓ抑制肿瘤细胞表达ＶＥＧＦ的情况。结果证明ＶＥＧＦ反义ＯＤＮｓ确有抑制ＶＥＧＦ表达的作用。结论反义ＶＥＧＦ的ＯＤＮｓ有望成为新一代的抗肿瘤药物。

N-甲基-D-天冬氨酸受体_1反义抑制剂治疗局灶性脑缺血作用机制的实验研究

目的 探讨N 甲基 D 天冬氨酸受体1(NMDAR1)反义抑制剂 (ASODN)治疗急性脑梗死的作用机制。方法 采用Koizumi’s线栓法制作可复流MCAO大鼠模型。4 0只 8～ 12月龄健康、雄性Wistar大鼠随机分为 4组 :(1)MCAO组 ;(2 )MCAO +PBS组 ;(3)MCAO +MSODN组 ;(4)MCAO +ASODN组。实验各组分别于MCAO后 2h、2 4h经侧脑室注射给药。MCAO后第 5天处死动物 ,取脑组织进行NMDAR1免疫组织化学及NMDAR1mRNA原位杂交检测。检测结果经CMIAS图像分析系统进行定量分析。结果 (1)ASODN治疗组NMDAR1阳性细胞在海马CA1区、CA3 区及DG区的数密度、光密度显著低于MCAO组 ;(2 )ASODN治疗组NMDAR1mRNA阳性细胞在海马各区及大脑皮层的数密度、光密度与MCAO组无显著差异。结论 NMDAR1反义抑制剂可能主要作用于NMDAR1基因的蛋白翻译过程 (胞浆机制 ) ,抑制缺血后神经元NMDAR1的产生 ,下调NMDAR1的数量及功能 ,减轻缺血后迟发性神经元坏死 ,达到脑保护作用。

反义抑制miR-222表达对替莫唑胺所致神经胶质瘤细胞DNA损伤作用的影响

目的探讨miR-222低表达的神经胶质瘤细胞(T98G-miR-222-)对替莫唑胺(TMZ)的DNA损伤反应。方法运用脂质体Lipofectamine 2000将anti-miR-222和anti-NC分别转染至T98G细胞后,分别用0、100、200、400和800μmol/L的TMZ处理转染T98G细胞,运用Northern blot等检测miR-222表达水平;以单细胞凝胶电泳(SCGE)检测DNA损伤指标彗性尾长。结果 TMZ引起T98G细胞DNA损伤指标彗星尾长增加,且有一定的剂量效应关系;anti-miR-222处理T98G细胞的DNA损伤指标彗星尾长显著高于同一剂量处理的anti-NC细胞。结论反义抑制miR-222表达可增强替莫唑胺所致神经胶质瘤细胞DNA损伤。

比较和分析NtGNL1的反义寡聚核苷酸抑制在烟草三种培养体系中的效果

为探讨反义寡聚核苷酸抑制(antisense oligodeoxynucleotides inhibition)技术在植物材料上的应用,以已知功能的NtGNL1(Nicotiana tabacum GNOM-Like1)为目标基因,寻找反义寡聚核苷酸抑制最适作用体系,并进一步分析NtGNL1的具体作用。根据目标基因mRNA序列设计反义寡聚核苷酸序列,商业合成后并将其添加到烟草胚珠、种子和花粉管离体培养的培养基中,以抑制NtGNL1的表达。结果表明,将反义寡聚核苷酸引入离体培养系统,短时间内抑制了目标基因mRNA的表达,但对胚胎发育过程的影响和种子萌发的抑制都不明显。在花粉离体萌发系统中,反义寡聚核苷酸抑制能够高效地引起目标基因mRNA的下调。对FM4-64染色的花粉管显微缩时观察发现,NtGNL1的下调能够引起囊泡分布和运输方向的改变。对花粉管膜流相关的5个基因的半定量分析也显示反义寡聚核苷酸进入花粉管后,导致3个基因的表达下调,暗示NtGNL1抑制表达会影响花粉管囊泡运输的多个节点。

反义纤溶酶原激活物抑制剂1 RNA对家兔动脉粥样硬化形成的影响

为探讨纤溶酶原激活物抑制剂 1反义RNA对家兔血浆纤溶活性及纤溶酶原激活物抑制剂 1的表达、血脂及对动脉粥样硬化斑块形成的影响 ,通过聚合酶链反应扩增纤溶酶原激活物抑制剂 1第二外显子 ,将聚合酶链反应产物纯化克隆后连入真核细胞表达载体pcDNA3.1,构建纤溶酶原激活物抑制剂 1反义RNA重组质粒。将pcDNA3.1 反义纤溶酶原激活物抑制剂 1重组质粒注射到哈尔滨大白兔腹部皮下组织。通过发色底物法测定家兔血浆组织型纤溶酶原激活物及纤溶酶原激活物抑制剂 1活性变化 ,通过免疫组织化学方法检测组织中纤溶酶原激活物抑制剂 1表达的改变。测定家兔血脂变化 ,病理检测其动脉粥样硬化程度。结果显示 ,应用反义纤溶酶原激活物抑制剂 1RNA重组质粒的家兔血浆纤溶酶原激活物抑制剂 1活性降低 ,组织型纤溶酶原激活物活性升高 ,纤溶酶原激活物抑制剂 1蛋白表达于内皮细胞 ,而在平滑肌细胞中未表达 (动脉粥样硬化对照组中内皮细胞、平滑肌细胞和泡沫细胞内均有表达 ) ;应用反义纤溶酶原激活物抑制剂 1RNA重组质粒的家兔胆固醇和甘油三酯明显低于动脉粥样硬化对照组 (96± 4 2mg L比 12 3± 12mg L ,15± 10mg L比 4 6± 2 9mg L) ,且动脉粥样硬化程度亦轻于后者。以上提示 ,反义纤溶酶原激活物抑制剂

反义金属蛋白酶组织抑制因子-1表达质粒对实验性肝纤维化的影响

目的 观察反义金属蛋白酶组织抑制因子 1(TIMP 1)表达质粒对实验性肝纤维化的影响。方法 运用重组DNA技术构建反义TIMP 1真核细胞表达质粒 ,经与糖化多聚赖氨酸偶联后 ,尾静脉注射将其导入猪血清诱导的免疫性大鼠肝纤维化模型体内 ;通过Northern印迹法、RT PCR、Western印迹法检测外源导入基因的表达 ,并通过肝组织间质胶原酶活性和羟脯氨酸测定 ,以及肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组织化学与VanGieson染色观察反义TIMP 1质粒对大鼠肝纤维化的影响。结果 外源导入基因可在肝组织中获得确切表达 ,其表达可增加间质胶原酶的活性 (P <0 .0 1) ,减少羟脯氨酸含量 (P <0 .0 1) ,促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解 (P <0 .0 1) ,并促进肝脏病理形态一定程度的改善 (P <0 .0 1)。结论 反义TIMP 1表达质粒对肝纤维化有较好的改善作用。

细胞周期激酶抑制因子4基因座中反义非编码RNA在急性髓细胞性白血病中的表达及与患者临床特征的关系

目的探讨细胞周期激酶抑制因子4基因座中反义非编码RNA(ANRIL)在急性髓细胞性白血病(AML)中的表达及与患者临床特征的关系。方法选取82例AML患者,作为观察组,依据患者病情分为初治组(n=53)、缓解组(n=19)和复发组(n=10),另选取31例非血液病健康者,作为对照组。采用实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测各组受试者骨髓ANRIL m RNA的相对表达量,并分析其与AML患者临床特征的关系。结果观察组、初治组、缓解组、复发组患者骨髓ANRIL mRNA的相对表达量均明显高于对照组(P﹤0.01)。复发组患者骨髓ANRIL m RNA相对表达量明显高于缓解组和初治组(P﹤0.01),缓解组患者骨髓ANRIL mRNA的相对表达量明显低于初治组(P﹤0.01)。血小板计数﹤20×10^(9)/L、疾病进展、预后未缓解或缓解后再复发AML患者骨髓ANRIL mRNA相对表达量分别明显高于血小板计数≥20×10^(9)/L、疾病无进展、预后缓解患者(P﹤0.01)。结论ANRIL在AML患者中高表达,其表达水平能反映患者的疾病严重程度,可指导临床诊疗。

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B反义RNA1靶向微小RNA-339-5p对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响

目的 探讨长链非编码RNA细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B反义RNA1(lncRNA CDKN2B-AS1)对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及分子机制。方法 收集南阳市中心医院2017年1月2019年1月收治的37例乳腺癌患者的癌组织及癌旁组织。将MDA-MB-453细胞分为CDKN2B-AS1阴性对照(si-NC组)、CDKN2B-AS1小分子干扰RNA(si-CDKN2B-AS1组)、CDKN2B-AS1小分子干扰RNA+miR-339-5p阴性对照(si-CDKN2B-AS1+anti-miR-NC组)以及CDKN2B-AS1小分子干扰RNA+miR-339-5p特异性寡核苷酸抑制剂(si-CDKN2B-AS1+anti-miR-339-5p组)。采用RT-qPCR法对CDKN2B-AS1及微小RNA-339-5p(miR-339-5p)表达水平进行检测;细胞周期及增殖活性检测分别采用流式细胞术及MTT实验;采用Transwell小室技术对细胞迁移和侵袭进行检测;采用Western blotting法对增殖标记蛋白细胞增殖核抗原-67(Ki67)、细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(P21)、上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)蛋白表达进行检测;荧光素酶报告实验检测CDKN2BAS1对miR-339-5p的靶向调控。结果 在乳腺癌组织中CDKN2B-AS1表达水平上调[(2.23±0.08)比(1.00±0.06)](P<0.05)。抑制CDKN2B-AS1可增加G0期细胞比例[(43.29±3.76)%比(30.25±3.01)%]、P21表达水平升高,S期细胞比例[(21.91±3.10)%比(34.19±3.32)%]、细胞存活率[(53.02±5.38)%比(100.00±7.12)%]、迁移、侵袭数以及Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达水平降低(P<0.05)。CDKN2B-AS1靶向调控miR-339-5p,抑制miR-339-5p逆转抑制CDKN2B-AS1对MDA-MB-453细胞增殖、迁移、侵袭的作用。结论 抑制CDKN2B-AS可抑制乳腺癌MDA-MB-453细胞增殖、迁移、侵袭,且靶向调控miR-339-5p表达。

根癌农杆菌介导反义fad2-1基因转化大豆的研究

通过根癌农杆菌介导法将反义fad2-1基因导入大豆子叶节,研究了农杆菌菌液浓度、预培养时间、共培养时间、恢复培养时间、乙酰丁香酮浓度和pH值对大豆子叶节形成丛生芽的影响,建立了有效的转化体系,获得了转基因大豆再生植株。PCR、PCR-Southern blotting检测结果表明,反义fad2-1基因成功转入并整合于大豆基因组。GC检测结果表明,转反义fad2-1基因大豆种子油酸含量比非转基因大豆种子的油酸含量提高了14.44%,而亚油酸含量降低了20.27%。

靶向23SrRNA domainⅡ区的肽-多肽核酸抑制细菌生长的研究

目的研究靶向23SrRNA domainⅡ区的肽-多肽核酸(PNA)(G1138)抑制细菌生长的效果。方法用浊度分析观察肽-PNA(G1138)抑制大肠埃希菌DH5α的生长,用克隆形成单位进一步分析肽-PNA(G1138)抑菌效果。结果肽-PNA(G1138)显示出剂量和序列特异性抑制细菌生长,但肽-PNA(G1138)的最低抑菌浓度(MIC)明显高于四环素,抑制效果低于四环素,他们的MIC分别为10和4μmol/L。结论10μmol/L的肽-PNA(G1138)能够抑制大肠埃希菌DH5α的生长,但与四环素和其他靶向23SrRNA domain V区的PNA比较起来抑菌效果不理想。筛选更有效的转运肽,提高肽-PNA(G1138)的抑菌效果,是以后研究中将要努力解决的问题。

膀胱癌组织LncRNA SPINT1-AS1表达及临床意义

目的检测膀胱癌组织长链非编码核糖核酸(LncRNA)丝氨酸肽酶抑制剂Kunitz 1型反义核糖核酸1(SPINT1-AS1)表达并探讨其临床意义。方法选取安阳市第三人民医院泌尿外科2018年1月至2023年2月收治的328例行腹腔镜下根治术膀胱癌患者作为研究对象,RT-qPCR检测膀胱癌组织和切缘正常组织LncRNA SPINT1-AS1的表达。比较不同临床病理特征患者癌组织LncRNA SPINT1-AS1的表达;随访至2023年5月,分析膀胱癌组织LncRNA SPINT1-AS1的表达与腹腔镜下根治术后复发的关系;Cox回归分析探讨影响膀胱癌患者腹腔镜下根治术后复发的危险因素。结果LncRNA SPINT1-AS1在膀胱癌组织的表达高于切缘正常组织(P<0.05);肌层浸润、TNM分期≥Ⅱb期、最大肿瘤直径≥3 cm、多发病灶、有淋巴结转移患者膀胱癌组织LncRNA SPINT1-AS1的表达分别高于非肌层浸润性、TNM分期<Ⅱb期、最大肿瘤直径<3 cm、单发病灶、无淋巴结转移患者(P<0.05);随访期间患者腹腔镜下根治术后复发率为15.88%(47/296);肌层浸润(HR=1.692,95%CI:1.157~2.475)、TNM分期≥Ⅱb期(HR=1.784,95%CI:1.187~2.682)、多发病灶(HR=1.837,95%CI:1.200~2.810)、膀胱癌组织LncRNA SPINT1-AS1表达(HR=1.557,95%CI:1.195~2.029)均为腹腔镜下根治术后复发的危险因素(P<0.05)。结论膀胱癌组织LncRNA SPINT1-AS1表达高于切缘正常组织,肌层浸润、TNM分期≥Ⅱb期、多发病灶及癌组织LncRNA SPINT1-AS1表达均为膀胱癌腹腔镜下根治术后复发的危险因素。

反义TIMP-1表达质粒对实验性肝纤维化的影响

目的观察反义TIMP-1真核表达质粒对实验性肝纤维化的影响。方法运用重组DNA技术及反义技术,构建反义TIMP-1真核细胞表达质粒,经脂质体Lipofectmine2000包埋。采用腹腔注射将其导入到复合因素复制的肝纤维化大鼠模型体内,通过半定量RT-PCR,病理形态学观察及免疫组化等方法,观察反义TIMP-1表达质粒对大鼠肝纤维化的影响。结果反义TIMP-1质粒组与肝纤维化组、空质粒组相比TIMP-1、MMP-13 mRNA及蛋白表达明显减少(P<0.05),空质粒组与肝纤维化组无显著性差异(P>0.05);正常对照组与各实验组之间的病理学分级有显著性差异(P<0.05);反义TIMP-1质粒组病理学分级较空质粒组有明显改善(P<0.05);空质粒组与肝纤维化组无显著性差异(P>0.05)。结论反义TIMP-1/pcDNA3.1(+)真核细胞表达质粒使TIMP-1、MMP-13 mRNA及蛋白的表达受到抑制,反义TIMP-1表达质粒对肝纤维化有较好的改善作用,并为以后肝纤维化的基因治疗奠定基础。